核苷酸结合寡聚化结构域样受体3炎症小体与阿尔茨海默病

冯芸颖，陈 慧

1中国医学科学院 北京协和医学院 基础学院，北京100730

2中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所免疫学系，北京 100005

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种慢性神经退行性疾病，据估计，2019年全球患有痴呆症的总人数超过5000万[1]，其中很大一部分是AD患者，AD已为社会和家庭带来严重负担，对全球卫生保健体系提出严峻挑战，亟需有效的预防及治疗措施[2]。AD的主要病理表现为进行性认知功能减退，出现痴呆和认知、执行能力减弱等症状。在神经病理学方面，AD的一般特征为大脑皮层和海马处细胞外β淀粉样蛋白(amyloid β protein，Aβ)的沉积、细胞内过度磷酸化的tau蛋白(一种微管相关蛋白)形成神经原纤维缠结以及胆碱能神经传递缺陷[3]。仅极少数AD患者(<5%)被确诊为遗传因素致病，而绝大部分偶发型AD的病因未明，也因此尚无有效的治疗方法。目前已研发出多种治疗AD的药物，其中不乏以Aβ为靶标的制剂，但其有效性均不明确，还需要进一步的临床证据。

越来越多的研究证实，神经炎症与AD病程发展有关。在中枢神经系统中，与神经炎症密切相关的免疫细胞主要是小胶质细胞和星形胶质细胞[4]，活化的小胶质细胞释放信号使周围其他细胞被不断激活，并被募集到蛋白斑块沉积处，吞噬沉积物并分泌促炎细胞因子。而在AD的炎症与组织损伤相关的细胞因子信号网络中，核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3)炎症小体是关键一环[5]。NLRP3炎症小体作为固有免疫应答中激活白细胞介素(interleukin，IL)- 1β、18的介质，在沉积物引起的小胶质细胞增生及蛋白聚集的病理学方面发挥重要作用。

NLRP3炎症小体

炎症小体是一种存在于细胞质中的免疫信号蛋白复合物[6]，一般由模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)、凋亡相关微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)和半胱氨酸蛋白酶caspase- 1组成。活化的炎症小体水解IL- 1β前体及IL- 18前体，诱导细胞焦亡，参与全身和局部感染、损伤与免疫反应[7]。根据受体蛋白的不同可将炎症小体进行分类。其中，NLRP3受体蛋白的N端为热蛋白结构域(pyrin domain，PYD)，中间为核苷酸结合结构域(nucleotide binding domain，NBD)，C端为亮氨酸富集结构域(leucine-rich repeat domain，LRR)，可识别病原体、微生物毒素、核酸、ATP和结晶物质等多种病原物质[8]，因此NLRP3炎症小体在固有免疫应答中的作用灵活且多样。

NLRP3炎症小体经典途径静息状态下细胞内NLRP3表达水平极低，故NLRP3炎症小体的活化需要预激活，病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)/损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)结合PRR，由核转录因子κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)通路上调NLRP3及相关细胞因子前体的基因表达[9]。NLRP3配体与NLRP3受体蛋白的LRR结构域结合后，蛋白的NBD结构域通过同型相互作用寡聚，而PYD结构域与ASC蛋白的PYD结构域也通过同型作用募集。多个组装的ASC蛋白纤维构成ASC蛋白斑块，而后ASC蛋白的caspase募集结构域(caspase activation and recruitment domain，CARD)通过CARD-CARD相互作用募集效应蛋白caspase- 1，使其自我裂解获得蛋白水解活性[10]，完成炎症小体的组装，裂解Gasdermin D蛋白(Gasdermin D，GSDMD)[11]，诱导细胞焦亡。有研究显示，丝氨酸/苏氨酸激酶NIMA相关蛋白激酶7(never in mitosis gene A-related kinase 7，NEK7)在有丝分裂间期参与组装和激活NLRP3炎症小体[12]，NEK7与NLRP3的寡聚对ASC蛋白斑块的形成和caspase- 1的活化有重要作用[13- 14]。

能够活化NLRP3炎症小体的刺激物种类多样、结构不一，故推测NLRP3炎症小体不是通过与刺激物直接相互作用从而被激活。目前关于炎症小体的激活过程有不同模型理论，其中以钾离子外流的模型最为普遍[15]，即细胞内钾离子浓度较低会激活NLRP3炎症小体，而抑制细胞内钾离子外流可以阻止NLRP3炎症小体的激活[16]。钙离子流动也是激活NLRP3炎症小体的关键事件[17]，但有研究发现了钙离子非依赖性的NLRP3炎症小体激活现象[18]。在炎症小体形成过程中，氯离子外流也会促进ASC的聚合[19]。除以上所述离子流动模型外，还有一些模型涉及细胞器活性。线粒体在氧化磷酸化过程中持续产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，在线粒体对ROS的清除功能减弱或丧失时，剩余ROS能够激活NLRP3炎症小体[20- 21]。可被NLRP3识别的多种物质均能引起细胞内高尔基体反面网状结构(trans Golgi network，TGN)解体，形成分散的dTGN，从而募集NLRP3在dTGN上组装形成活化的炎症小体[22]。结晶物质不直接作用于NLRP3受体蛋白，其通过溶酶体的吞噬作用，诱导溶酶体酸化、溶胀，通过钾离子外流激活炎症小体[15]。不同的模型理论中许多途径相互关联、重叠，也存在矛盾，目前尚不能完善地解释NLRP3炎症小体的激活机制。

NLRP3炎症小体的其他途径在以上所述的NLRP3炎症小体经典途径之外，还存在其他活化途径。革兰氏阴性菌释放的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)在胞质中与鼠caspase- 11或人caspase- 4和caspase- 5结合，引发NLRP3炎症小体非经典途径[23]。活化的caspase- 4/5裂解GSDMD，诱导泛连接蛋白(pannexin)与P2X7受体介导的细胞焦亡[24]。经pannexin通道的钾离子外流会激活NLRP3受体蛋白，形成NLRP3炎症小体。DAMP也可激活或抑制NLRP3炎症小体非经典途径[25- 26]。NLRP3炎症小体的非经典途径与经典途径存在相互作用，并且已有综述对此进行总结[27]。在人单核细胞中还发现LPS能通过TLR4-TRIF-caspase- 8途径激活NLRP3炎症小体使IL- 1β成熟，该过程不涉及钾离子外流和细胞焦亡，是NLRP3炎症小体的旁路途径[28]。

NLRP3炎症小体的调节在预激活阶段，经MyD88的TLR4信号转导能够以非转录机制在基础NLRP3表达水平上迅速激活炎症小体，该过程可能与线粒体活性氧的产生有关，且研究显示NLRP3受体蛋白的去泛素化会促进NLRP3炎症小体的激活[27]。caspase- 8和Fas相关死亡结构域蛋白(Fas-associated protein with death domain，FADD)在这一阶段也可以调节NLRP3蛋白[29]。NLRP3蛋白不同位点的磷酸化可以促进或抑制炎症小体的形成[30- 31]；静止细胞中多个位点被类泛素化的NLRP3处于抑制状态，而突变导致的类泛素化缺陷能够使NLRP3过度激活[32]。其他蛋白质组分也能够在装配过程中发挥调节作用，研究显示通过磷酸化NEK7，NLRP3炎症小体被中心体蛋白Spata2抑制[33]，表明中心体和炎症小体之间存在动态相互作用。

同种刺激物可能激活不同炎症小体，同时发挥作用。疟原虫产生的疟色素和DNA会引起NLRP3和黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)类炎症小体活化[34]。沙门氏菌可同时激活NLRP3和核苷酸结合寡聚结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family CARD domain containing 4，NLRC4)，显微镜下显示感染时NLRP3和NLRC4的共定位现象[35]。目前此类研究大多涉及NLRP3炎症小体，但尚不清楚这类双重激活效应的具体模式。

NLRP3炎症小体与AD

中枢神经系统的小胶质细胞内含有NLRP3炎症小体组装所需的全部组件。DAMP通过磷酸化Toll样受体激活小胶质细胞内NF-κB通路，促进促炎细胞因子IL- 1β前体、IL- 18前体和NLRP3受体蛋白的表达。小胶质细胞吞噬Aβ，可导致细胞内溶酶体溶胀破裂[5]，仅此就足以作为激活NLRP3炎症小体的内源性信号。有研究证实，Aβ引发野生型小鼠小胶质细胞内钙离子、ATP的释放，炎症小体激活，间接导致IL- 1β分泌增加，P2X7缺失型小鼠则无此现象[36]。IL- 1β通常在健康大脑中维持在低水平，而在有淀粉样斑块沉积的小鼠和AD患者中发现IL- 1β水平有所升高，caspase- 1剪切活性大幅提高[37]是其直接原因。IL- 1β分泌增加也会继续促进小胶质细胞合成相关炎性细胞因子，并可能导致具有潜在神经毒性的细胞因子聚集。此外，AD中淀粉样斑块释放神经毒性因子募集小胶质细胞也会放大Aβ的神经毒性作用，进一步影响周围组织[38]。近来有研究显示，相对分子质量较低的Aβ寡聚体也能够激活NLRP3炎症小体，表明可能在Aβ蛋白斑块沉积前被激活的小胶质细胞就能够启动中枢神经系统的固有免疫应答[39]。根据基因表达谱可将活化的小胶质细胞分为不同亚型。AD小鼠模型中，NLRP3炎症小体诱导小胶质细胞M1型活化，对IL- 1β等促炎细胞因子的表达增加，削弱吞噬清除Aβ的作用并造成神经损伤[40]。在AD小鼠模型(APP/PS1小鼠)中敲除NLRP3受体蛋白或ASC，则淀粉样斑块沉积的症状得到缓解，说明特异性阻断小胶质细胞中的NLRP3可使小胶质细胞向M2型活化，分泌抗炎细胞因子，最终会减少细胞外Aβ蛋白沉积，防止突触功能障碍和认知功能减退[37]。

细胞内tau蛋白沉积不是AD的主要病理特征，因此AD被认为是一种继发性tau蛋白疾病[41]。而NLRP3炎症小体在AD疾病中的作用不仅与Aβ有联系，还与tau蛋白相关，Aβ蛋白诱导的tau蛋白病变中也有NLRP3炎症小体的参与。有证据表明，NLRP3炎症小体功能缺失能够显著缓解tau蛋白的过度磷酸化，因此可以在一定程度上遏制tau蛋白疾病进程。tau蛋白寡聚体或单体也可以激活NLRP3炎症小体，影响AD致病进程[42]。

以NLRP3炎症小体为靶标治疗AD

由于NLRP3炎症小体在AD病程进展中起重要作用，以其为靶标治疗相关疾病成为研究的一大热点。目前针对NLRP3炎症小体通路及其调节机制，已有多项研究提出潜在抑制靶点，并报道了相应的NLRP3抑制剂，直接或间接抑制炎症小体组分及相关信号通路。

非甾体类抗炎药物(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)是一类不良反应很小的抗炎药物，作用于环氧合酶(cyclooxygenase，COX)1和COX2。甲芬那酸是一种常用NSAID，已显示出选择性抑制NLRP3炎症小体的作用，具体机制与氯离子通道有关。该药物能够完全阻止小胶质细胞活化以及IL- 1β在AD相关神经炎症中的表达。实验证明，甲芬那酸可以减轻神经元培养物中淀粉样蛋白的毒性作用并缓解注射淀粉样蛋白单体的大鼠记忆力减退的症状[43]。

磺胺类药物是一类具有广谱抑菌活性的化学合成药，其中有些药物能够通过血脑屏障渗入脑脊液，如磺酰胺类似物JC- 124。JC- 124在NLRP3激活步骤中对多种刺激模式起作用，可以选择性抑制NLRP3炎症小体的形成和caspase- 1的活性，被证实能够缓解TgCRND8和APP/PS1小鼠的AD症状并改善其认知功能[44]。

姜黄素是从姜黄根茎中提取出的一种天然疏水性多酚，可对NLRP3炎症小体通路造成干扰。姜黄素在体外神经元培养物中能够结合并破坏Aβ蛋白斑块，对神经元起保护作用[45]。因此，姜黄素类似物也是AD的潜在有效药物。

黄体酮(progesterone，PG)是一种具有神经活性的类固醇，近来有研究表明，PG通过增强自噬作用显著抑制Aβ诱导的星形胶质细胞中NLRP3炎症小体激活，起到保护神经的作用[46]。而在小胶质细胞中是否有同样作用仍待进一步研究。

在大鼠淀粉样蛋白注射模型中也发现，用P2X7拮抗剂进行药理干预有效[36]。虽然P2X7受体在不同种类细胞中具有多样功能，因而可能存在脱靶效应，但在AD中多种细胞的P2X7受体表达均有所提高，影响淀粉样蛋白斑块的形成，所以该靶点仍有一定的研究价值。

组织蛋白酶B是caspase- 11的上游激活物，组织蛋白酶B的抑制剂CA074Me在AD小鼠模型中显示出一定的治疗效果[47]，但也有证据表明组织蛋白酶B在淀粉样蛋白降解中有作用[48]，因此需进一步研究该靶点的可行性。

阻滞IL- 1、IL- 18信号转导的特异性抗体已经在美国获准用于多种炎症性疾病治疗[49]，靶向该位点的AD治疗也取得一定进展[50]。但研究发现，IL- 1 1型受体(interleukin- 1 receptor 1，IL- 1R1)基因敲除小鼠出现认知缺陷，提示抑制IL- 1R1可能对AD产生负面影响[51]。

目前对NLRP3炎症小体组成蛋白直接进行抑制的有效药物比较有限，药物设计多采用抑制NEK7[52]、阻断结构域相互作用位点、改变NLRP3泛素化状态[53]、改变蛋白磷酸化水平[54]等几条主要思路，且对于治疗AD的有效性尚不明确，需要结合AD动物模型继续研究。

总结与展望

NLRP3炎症小体在固有免疫中起重要作用，并参与中枢神经系统的神经炎症反应。在啮齿动物的中枢神经系统中，NLRP3炎症小体在小胶质细胞、星形胶质细胞甚至神经元中均存在[55]，因此参与炎症反应的细胞不仅局限于小胶质细胞。已有大量证据将NLRP3炎症小体与AD的发病机制及病程进展联系起来，提示其作为AD治疗靶点的可能。NLRP3炎症小体通路及AD相关药物靶点见图1。

NLRP3：核苷酸结合寡聚化结构域样受体3；DAMPs：损伤相关分子模式；PAMPs：病原相关分子模式；NF-κB：核转录因子κB；FADD：Fas相关死亡结构域蛋白；ROS：活性氧；ASC：凋亡相关微粒蛋白；PYD：热蛋白结构域；NBD：核苷酸结合结构域；LRR：亮氨酸富集结构域；CARD：caspase募集结构域；IL：白细胞介素；GSDMD：Gasdermin D蛋白；①：NLRP3炎症小体经典途径；②：NLRP3炎症小体非经典途径；③：NLRP3炎症小体旁路途径NLRP3：nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3；DAMPs：damage-associated molecular patterns；PAMPs：pathogen-associated molecular patterns；NF-κB：nuclear factor-κB；FADD：Fas-associated protein with death domain；ROS：reactive oxygen species；ASC：apoptosis-associated speck-like protein containing CARD；PYD：pyrin domain；NBD：nucleotide-binding domain；LRR：leucine-rich repeat；CARD：caspase activation and recruitment domain；IL：interleukin；GSDMD：Gasdermin D；①：the canonical activation of NLRP3 inflammasome；②：the non-canonical activation of NLRP3 inflammasome；③：the alternative activation of NLRP3 inflammasome图1 NLRP3炎症小体通路及阿尔兹海默病相关药物靶点示意图Fig 1 NLRP3 inflammasome pathways and relevant drug targets for Alzheimer’s disease

实际上，炎症反应对于AD的进展具有双重作用，并取决于特定的局部生理或病理环境。因此，控制NLRP3炎症小体、保持中枢系统免疫细胞在适当的活化水平从而维持固有免疫应答的平衡状态对AD患者是有益的。尽管我们对于NLRP3炎症小体通路的探索已取得很大进展，但其在AD中的确切机制有待更深入的研究。NLRP3炎症小体通路涉及广泛，其组分存在其他旁路调节功能，若以该通路靶向治疗AD，在一些靶点可能会出现脱靶效应，还需要对治疗药物及方式进行全面评估。此外，由于NLRP3炎症小体在全身免疫系统的固有免疫应答中均扮演重要角色，以NLRP3炎症小体为靶标对AD进行治疗时不仅要考虑症状的治疗效果，还要考虑抑制炎症小体功能对中枢神经系统外免疫状态的影响，因此，以靶向给药、研发中枢神经系统特异性抑制剂等方式进行更加精准的局部调控是未来研究方向的重点。