腹主动脉瘤和动脉粥样硬化患者肠道菌群的多样性差异

吉 磊，顾光超，陈思良，王 威，任金锐，李方达，吴建强，杨 丹，郑月宏

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 1血管外科 2医学研究中心，北京100730

3中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所生物信息学研究中心，北京100193

腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)是指肾下主动脉的局部全层扩张，且扩张直径大于3 cm或超过正常管径的50%，65岁以上人群的发病率约为4%～8%，一旦破裂，死亡率可达80%[2]。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是AAA的一个重要独立危险因素[3]，Ito等[4]研究显示，53%的AAA患者并发冠心病，若筛查其他大中动脉，AS合并率可能更高。AAA和AS存在一些共同的危险因素，如吸烟、衰老、家族史、男性等，且从分子层面，现有的数据尚不能证实AAA和AS是两种独立的疾病。AAA的病理学特征主要包括慢性炎症、平滑肌细胞凋亡、细胞外基质降解等[5]，这些特征同时可促进AS斑块的形成[6]。这些证据意味着AS可能是AAA发病的重要阶段。然而，对两种疾病的全基因组测序研究发现，AAA和AS虽在脂质代谢、平滑肌细胞功能和炎症调控等方面具有相似的遗传途径[7-9]，但仍存在大量独立的致病基因位点[10]。AAA和AS的关系问题尚存争议，因此，从不同角度寻找这两种疾病的差异十分必要。肠道菌群作为人体“第二基因组”参与了多种心血管疾病的发生发展[11]。越来越多的证据表明，肠道菌群失调与AS发病之间存在明显的相关性[12]。同样，以载脂蛋白E敲除小鼠为模型的动物实验表明，血管紧张素Ⅱ造模成功的AAA小鼠在α、β多样性方面与对照组小鼠均有较大差异[13]。但AAA和AS在人体肠道菌群方面的差异尚未见报道。本研究拟采用16S rDNA高通量测序技术，从人体肠道微生物角度，探索AAA和AS的差异点，从而为后续两种疾病发病机制的相关性研究和差异化治疗提供参考。

对象和方法

对象及分组2018年12月至2019年6月在北京协和医院血管外科经超声或CT确诊的年龄≥60岁的AAA患者(AAA组)，诊断标准为肾下主动脉直径大于3 cm或超过正常直径的1.5倍，同时超声或CT确认AAA患者在主动脉或分支动脉处合并无症状性AS。2018年12月至2019年6月在北京协和医院血管外科经超声或CT确诊AS所致的年龄≥60岁的颈动脉狭窄患者(AS组)。排除标准：6个月内患者有抗生素、益生菌和胃肠道疾病相关药物使用史，腹部手术史，传染病、食物不耐症和炎症性肠病病史，短期内饮食结构发生变化。此外，排除炎性、感染性动脉瘤等其他病因所致的AAA。记录所有研究对象的年龄、性别、体质量指数和合并疾病等临床数据。本研究经北京协和医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书(JS- 2629)。

样本采集清晨空腹状态下采集研究对象的新鲜粪便置于专用的粪便保存管内，而后迅速将其放入液氮罐内速冻，转运至生物样本库储存于-80 ℃冰箱中。嘱研究对象在收集粪便样本前将尿液排尽，避免污染粪便。

测序过程

粪便样本DNA提取和质检：根据操作说明，使用DNA提取试剂盒(TIANamp Stool DNA kit，北京天根生化科技有限公司)提取粪便样本DNA。利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度计(美国ThermoFisher公司)和1% 琼脂糖凝胶电泳进行总DNA质检。

引物设计并合成：16S rDNA扩增选择区域为V3-V4区，使用的通用引物为341F和806R。引物设计：forward primer(5’- 3’)：CCTACGGGRSGCAGCAG(341F)；reverse primer(5’- 3’)：GGACTACVVGGGTATCTAATC(806R)。

PCR扩增和产物纯化：以稀释后的基因组DNA为模板，使用KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR kit(瑞士Roche公司)高保真酶进行PCR，确保扩增的准确性和高效性。 采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(美国AXYGEN公司)切胶回收PCR产物。回收后，利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度计和2%琼脂糖凝胶电泳进行文库质检。文库质检合格后，使用Qubit进行文库定量，并根据每个样品的数据量要求，进行相应比例的混合。

Illumina测序：采用Illumina Miseq PE250(美国Illumina公司)进行上机测序。设计16S特定引物扩增特异区域，得到 425bp 左右扩增片段。加接头，采用Illumina平台，测序得到PE250的 Paired-End数据，通过拼接得到较长序列，从而进行后续分析。

分析方法

OTU分析：为便于下游物种多样性分析，将长Reads聚类为操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)。利用Usearch在97%相似度下进行聚类，将序列按照彼此的相似性人为分归为许多小组，1个小组就是1个OTU。

α和β多样性分析：利用QIIME软件计算样品的α多样性指数值，并做出相应的稀释曲线。分别对α多样性的各个指数进行秩和检验分析，通过秩和检验筛选不同条件下显著差异的α多样性指数。通过QIIME软件，采用迭代算法计算β多样性指数的值，分别在加权物种分类丰度信息和不加权物种分类丰度信息的情况下进行差异计算。

显著性差异分析：线性判别分析效应值(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)采用线性判别分析来估算每个组分丰度对差异效果影响的大小，找出对样品划分产生显著性差异性影响的群落或物种。本分析采用LEfSe Tools进行。使用秩和检验的方法进行显著性差异分析，以找出对组间划分产生显著性差异影响的物种。

统计学处理采用GraphPad Prism 7.04统计软件，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料采用频数和百分比进行描述，组间比较采用卡方检验；P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

临床特征根据纳入和排除标准，AAA组和AS组均纳入20例患者，两组在性别、年龄、体质量指数、高血压、糖尿病、冠心病、吸烟、饮酒等方面差异均没有统计学意义(P均>0.05)(表1)。

表1 两组患者临床特征比较(n=20)Table 1 Comparison of clinical characteristics between two groups(n=20)

物种分类和丰度分析通过16S rDNA高通量测序技术，共获得有效序列1 422 567条，其中，AAA组722 298条，AS组700 269条。在对有效序列进行OTU聚类和抽平处理后，样品物种丰富度α指数(chao1)稀释曲线趋于平缓(图1A)。根据每个样品的OTU在每个样品的丰度，计算出每个样品或组间共有和特有的。AAA组独有OTU为47个，AS组独有的OTU为104个，两组间共有的OTU为416个(图1B)。肠道内菌群绝大多数归属于厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门4类。AAA组和AS组在菌门水平和优势物种方面的组间相似度较高，在属水平可能存在一些差异菌属(图1C、D)。

AS：动脉粥样硬化；AAA：腹主动脉瘤；OTU：操作分类单元AS：atherosclerosis；AAA：abdominal aortic aneurysm；OTU：operational taxonomic unitA.样品物种丰富度α指数稀释曲线图；B.韦恩图，橙色代表AS组独有的OTU数目，蓝色代表AAA组独有的OTU数目，橙色和蓝色相交的灰色部分代表AS组和AAA组共有的OTU数目；C.门水平两组间物种谱对比柱状图；D.属水平两组间物种谱对比柱状图A.rarefaction curves of Chao1 index representing microbial richness of samples；B.Venn diagram，the orange and blue parts indicate the unique OTUs in AS and AAA groups，respectively，and the gray part indicate the common OTUs shared between AAA and AS groups；C.the relative abundance of gut microbiota at the phylum level between two groups；D.the relative abundance of gut microbiota at the genus level between two groups图1 物种组成和丰度分析Fig 1 Microbial composition and relative abundance

α和β多样性分析α多样性是对单个样本中物种多样性的分析，采用5种常用指数来度量：Observed species和Chao1反映样本中物种丰富度，但不考虑每个物种的占比情况(均匀度)；Shannon和Simpson反映物种的丰富度和均匀度；Good’s Coverage反映样本的测序深度，以上5种度量方法均提示AAA组和AS组在α多样性方面差异无统计学意义(P均>0.05)，选择 Chao1(P=0.97)和Shannon指数(P=0.51)作代表性展示(图2A、B)。与α多样性不同，β多样性是用来比较各样本在物种多样性方面存在的差异。Anosim(Weighted，P=0.077)、Adonis(Weighted，P=0.051)等多种分析方法发现，尽管得到的数据表明两组间的差异并未达到统计学差异，但AAA组和AS组间仍然存在一定的菌群组成差异(图2C～F)。

R>0代表组间差异大于组内差异R>0 indicates the difference between groups is greater than that within groupsA.Chao1指数比较菌群丰富度；B.Shannon指数比较菌群丰富度和均匀度；C.加权物种分类丰度信息情况下Adonis分析比较两组间β多样性差异；D.加权物种分类丰度信息情况下Anosim分析比较两组间β多样性差异；E.不加权物种分类丰度信息情况下Adonis分析比较两组间β多样性差异；F.不加权物种分类丰度信息情况下Anosim分析比较两组间β多样性差异A.comparison of Chao1 index representing microbial richness；B.comparison of Shannon index representing microbial richness and homogeneity；C.weighted Adonis analysis of β diversity；D.weighted Anosim analysis of β diversity；E.unweighted Adonis analysis of β diversity；F.unweighted Anosim analysis of β diversity图2 α和β多样性分析Fig 2 Analyses of α and β diversities

显著性差异菌群分析LEfSe分析结果显示，AAA组明串珠菌科、魏斯氏菌属、粪杆菌属、瘤胃球菌科较AS组为优势菌。而AS组厚壁菌纲、Selenomonadales菌目、韦荣氏菌科显著增加(图3A)。从属水平差异性分析显示，两种差异菌属——魏斯氏菌属和粪杆菌属均在AAA组样本中含量增加(图3B、C)。

LEfSe：线性判别分析效应值LEfSe：linear discriminant analysis effect sizeA.LEfSe分析；B.显著差异菌属的PCA分析，横纵坐标分别表示第1和第2主坐标，百分比则表示相应主坐标对样品差异的贡献率；C.显著差异菌属比较箱型图A.LEfSe；B.PCA of significantly differential genera，the abscissa and ordinate denote principle components 1 and 2，respectively，and the percent represents the contribution rate of the corresponding principal component to the sample difference；C.boxplot for the comparison of significantly differential genera图3 LEfSe和显著性差异菌属分析Fig 3 LEfSe and significantly differential genera

讨 论

本研究通过对AAA与AS肠道菌群的比较，发现两组患者在菌群均匀和丰富度上具有很大的相似性，其根源在于两类疾病可影响菌群的致病因素谱高度重合，但β多样性分析证实两组间在菌群多样性方面存在一定差异。进一步通过LEfSe分析发现，厚壁菌纲、Selenomonadales菌目、韦荣氏菌科、明串珠菌科、魏斯氏菌属、粪杆菌属等不同水平的差异菌群。在属水平差异分析中，魏斯氏菌和粪杆菌属均在AAA组显著增加。

魏斯氏菌属是一种异型发酵、兼性厌氧的革兰氏阳性细菌，1993年由Collins等[14]首先发现并报道。魏斯氏菌属在腌制类发酵食品中广泛存在，如酱油、泡菜等[15]。生物作用上，魏斯氏菌属可将原料转化为短链脂肪酸，同时促进胆固醇向胆盐异化并加快体外排泄，从而发挥抗炎、降胆固醇的作用[16-17]，因此一般被认为是有益菌。但魏斯氏菌属富集的腌制类发酵食物往往伴随着高盐，Golledge等[18]对11 742人的盐分摄入问卷调查结合AAA筛查研究发现，高盐饮食组AAA患病率增加。此外，在机体不同的器官微环境下，有益菌可能存在有害的一面。有学者报道魏斯氏菌属与菌血症、脓肿、关节假体感染和感染性心内膜炎等相关[19]。尤其是在一些存在免疫缺陷的患者体内，魏斯氏菌属可增多并发生肠道移位，进而成为优势致病菌造成感染[20]。免疫功能紊乱与AAA发病联系密切[21]，魏斯氏菌属的增多可能从侧面证实这一点。

粪杆菌属是一种无孢子形成、严格厌氧的革兰氏阳性细菌，约占正常人体肠道菌群的5%[22]。研究表明，肠道微生态失调导致的粪杆菌属减少，与银屑病、炎症性肠病和结肠癌等多种疾病呈正相关[23]。慢性炎症是AAA和AS共同的病理特征，但炎症相关的一些关键调节因子，如细胞因子等，可能在这两种心血管疾病中发挥相反的作用[24]。Rabiei等[25]报道粪杆菌属及其胞外囊泡处理的人肠上皮细胞表达的干扰素-γ相比对照组显著降低。早期研究表明，将重组干扰素-γ注入CD4+T细胞缺乏的小鼠可导致动脉瘤发生[26]。然而，King等[27]利用血管紧张素Ⅱ诱导的AAA小鼠研究发现，干扰素-γ缺乏在AAA中起保护作用。以上证据说明作为有益菌的粪杆菌属在AAA发病中可能起负面作用。

大量研究已从各个角度证实肠道菌群紊乱与AS发病存在一定的相关性[28-30]。AS与肠道菌群的相关性主要体现在以下3个方面：(1)肠道菌群直接感染。有研究表明，在AS斑块中存在相当含量的细菌DNA[31]。进一步研究证实，这些斑块中的细菌可能来自口腔或肠道[32]。(2)肠道菌群通过调控胆固醇和脂质代谢影响AS的发展。Fu等[33]通过893例患者的大队列研究发现，34个菌群单元与体质量指数、三酰甘油和高密度脂蛋白相关。但有趣的是，在该队列中，肠道菌群对总胆固醇和低密度脂蛋白的影响较小。(3)肠道菌群的代谢产物影响AS发病。目前发现，与AS相关的代谢产物主要包括氧化三甲胺(trimethylamine oxide，TMAO)、短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)等[34-35]。以TMAO为例，食物中的胆碱等经肠道细菌代谢为三甲胺入血，而后在肝脏中经黄素单氧化酶转化成TMAO[36]。一些研究证实，TMAO可通过抑制胆固醇的逆向转运和激活炎症相关信号通路发挥促AS的作用[37-38]。

脂质代谢组学发现，AAA和AS导致外周动脉疾病的血清代谢谱存在一定差异[39]，结合上述总结，对AAA和AS的肠道菌群差异研究十分必要。本研究利用16S rDNA高通量测序技术发现，AAA和AS患者在菌群丰富度、均匀度和大多数菌属方面具有较大相似性，两组患者粪便样本中厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门的相对丰度没有明显差异。而在属水平，曾有研究表明粪杆菌属在冠状动脉粥样硬化性心脏病患者粪便中富集[40]，提示粪杆菌属可能为AS的致病菌之一，同时在本研究中，粪杆菌属在AAA组显著富集，因此结论后期扩大样本量，增加健康对照组后进一步阐释。

本研究存在以下局限性：(1)入组患者均来自北京协和医院血管外科，具有明显的地域性。为保证组间样本的一致性，AS组均为颈动脉狭窄患者，并不能完全代表AS。(2)影响肠道菌群组成的因素很多，如饮食、环境等，本研究无法全面考虑这些可能影响菌群的潜在因素，研究成果未来还需加大样本量联合多中心加以证实。本研究结果是对AAA和AS两种疾病在人体肠道微生物组方面差异的初步探索，发现的差异菌属还需构建相关动物模型，增加测序深度，如采用宏基因组学，并联合其他组学如代谢组学等予以进一步验证。