基于Nrf2/SIRT3/SOD2途径探讨正清风痛宁抗骨质疏松的作用机制

吴春根 陈平 吴雯昱 谭利琴*

1.南昌大学第四附属医院疼痛科，江西 南昌 330003 2.北京中医药大学，北京 100029

骨质疏松症是一种与年龄相关的全身性骨病，多发于老年人群，其特点是骨量逐渐减少，骨微结构破坏，骨质脆性，会造成患者全身骨骼疼痛、躯体功能下降、严重影响人们的日常生活质量。正清风痛宁的主要成分是青藤碱，是从中草药青风藤中提取的一种单体生物碱，现代药理研究发现其具有镇痛、抗炎等作用[1-2]，治疗骨性关节炎、骨质疏松等引起的疼痛性疾病疗效得到广泛认可[3-4]，但其在抗骨质疏松方面的研究却鲜有报导。诸多研究表明氧化应激也参与骨质疏松症的发生过程，核因子 E2 相关因子 2(Nrf2)是抗氧化反应的关键转录因子，有报道表明Nrf2 在骨发育代谢中也发挥重要角色[5]。沉默信息调节因子3(SIRT3)作为调控线粒体形态功能的一个重要蛋白质，不但能促进成骨分化，还能抑制破骨分化，在调节骨质疏松进程中发挥重要作用[6]。基于此，本研究以醋酸泼尼松诱导骨质疏松模型大鼠，观察正清风痛宁对模型大鼠的改善作用，并通过Nrf2/SIRT3/SOD2途径探讨其内在的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：40 只雄性 SD 大鼠，3 月龄，体重280～340 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.2药物与试剂：正清风痛宁片(四川太极制药有限公司，规格：20 mg，国药准字Z51020160)；醋酸泼尼松(广东华南药业，批号 060328)；碱性磷酸酶(ALP)、降钙素(CT)、丙二醇(MDA)、超氧化物歧化酶2(SOD2)试剂盒(南京建成生物科技有限公司)；Ⅰ型胶原羧基末端交联肽(β-CTX)、骨钙素(BGP)(德国罗氏诊断产品有限公司)；DAB蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；辣根酶标记山羊抗兔IgG、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(上海宏盛)；β-actin小鼠抗大鼠单克隆抗体(Sigma)；RT-PCR反转录试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司)；Western blot增强化学发光试剂盒(美国Millipore公司)。

1.1.3仪器：PLODIGY 型骨密度仪(美国Lunar 公司)；超声匀浆器(日本SANYO公司)；低温高速离心机(美国IEC公司)；X73型倒置荧光显微镜(日本OLYMOUS公司)；凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1动物分组及模型制备：80只雌性SD大鼠随机分为4组：正常对照组、骨质疏松组、正清风痛宁组、对照药白藜芦醇组，每组20只。除正常对照组外，其余大鼠灌胃给予醋酸泼尼松[5 mg/(kg·d)]，用0.5 % CMC-Na配成0.5 mg/mL的浓度，给药体积10 mL/kg，每周2次，4周后正清风痛宁组和对照药组分别给予正清风痛宁[20 mg/(kg·d)]和白藜芦醇[5 mg/(kg·d)]，用0.5 % CMC-Na配制，浓度分别为2 mg/mL和0.5 mg/mL，给药体积为10 mL/kg，正常对照组每日给等量的0.5 % CMC-Na溶液，以上给药每日一次，连续给药8周。

1.2.2取材：血样收集：大鼠末次给药后，禁食24 h，次日用3 %戊巴比妥钠(5 mg/kg)腹腔注射麻醉，右心室彻底抽血处死。收集血液后，4 ℃ 静置3 h，3 000 r/min离心10 min，血清分装于小EP管中，-70 ℃冷冻备用。

骨标本收集：大鼠处死后，取两侧股骨和第五椎体(L5)，剔除肌肉及筋膜(保留骨膜)等软组织，右股骨和L5用生理盐水冲洗，用生理盐水浸润的医用纱布包裹，再用锡纸包裹，置-70 ℃冰箱冻存，用作骨密度及股骨近端孔隙检测。

左侧股骨经脱钙后制备石蜡切片，用作HE染色、Western blot 检测。

1.2.3血清ALP、CT水平测定：ELISA 法检测血清ALP、CT水平。检测步骤按试剂盒说明书进行操作。

1.2.4血清β-CTX、BGP水平检测：电化学发光免疫分析法测定血清 β-CTX、BGP 水平，检测步骤按试剂盒说明书进行操作。

1.2.5血清SOD2、MDA水平测定：ELISA 法检测血清SOD2、MDA水平。检测步骤按试剂盒说明书进行操作。

1.2.6骨密度、股骨近端孔隙率检测：用骨密度仪测量各组大鼠L5和右股骨的骨密度(BONe mineral density，BMD)及股骨近端孔隙率。

1.2.7HE染色观察股骨结构的病理改变：取大鼠左股骨，剔除肌肉组织及筋膜，置于10 %中性甲醛固定72 h，然后再放入10 % EDTA (pH 7.4)溶液3个月进行脱钙，每周更换1次脱钙液。完成后冲水 24 h，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，HE染色，中性树胶封片，倒置显微镜下观察病理变化。

1.2.8Western blot 测定各组大鼠的骨组织中Nrf2、SIRT3蛋白的表达情况：股骨低温研磨破碎，加入RIPA 裂解液提取组织蛋白，BCA 法测定蛋白质量浓度。取少量蛋白质配成上样缓冲液，加入15 %的 SDS-PAGE 电泳胶进行电泳，转膜，5 %的脱脂牛奶封闭 1 h，加入一抗Nrf2(1∶1 000)、SIRT3(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，加入二抗，室温孵育 2 h，用 ECL 化学发光试剂显色，化学发光成像，以相应的 β-actin 作为内参，用 Image J 图像分析软件对结果进行半定量分析，计算各目标条带的灰度值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 血清ALP、CT水平

骨质疏松组大鼠血清ALP、CT水平均明显低于正常对照组(P<0.01)，正清风痛宁组ALP、CT水平较骨质疏松组显著升高(P<0.01)，见图1。

注：与正常对照组比较，#P<0.05，## P<0.01；与骨质疏松组比较，*P<0.05，** P<0.01。图1 正清风痛宁对骨质疏松大鼠血清ALP、CT水平的影响Fig.1 The effect of Zhengqingfengtongning on serum ALP and CT content in osteoporotic rats

2.2 血清β-CTX、BGP水平

骨质疏松组大鼠血清 β-CTX水平明显高于正常对照组，BGP水平明显低于正常对照组(P<0.01)，正清风痛宁组大鼠血清 β-CTX水平较骨质疏松组明显降低，BGP水平较骨质疏松组显著升高(P<0.01)，见图2。

注：与正常对照组比较，#P<0.05，## P<0.01；与骨质疏松组比较，*P<0.05，**P<0.01。图2 正清风痛宁对骨质疏松大鼠血清 β-CTX、BGP水平的影响Fig.2 The effect of Zhengqingfengtongning on serum β-CTX and BGP content in osteoporotic rats

2.3 血清MDA、SOD2水平

骨质疏松组大鼠血清MDA水平明显高于正常对照组，SOD2活性明显低于正常对照组，(P<0.01)，正清风痛宁组大鼠血清MDA水平较骨质疏松组明显降低，SOD2活性较骨质疏松组明显升高(P<0.01)，见图3。

注：与正常对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与骨质疏松组比较，*P<0.05，**P<0.01。图3 正清风痛宁对骨质疏松大鼠血清MDA、SOD2水平的影响Fig.3 The effect of Zhengqingfengtongning on serum MDA and SOD2 levels in osteoporotic rats

2.4 骨密度

骨质疏松组大鼠BMD明显低于正常对照组(P<0.05)，正清风痛宁组大鼠BMD较骨质疏松组明显升高(P<0.01)，见图4。

注：与正常对照组比较，#P<0.05，## P<0.01；与骨质疏松组比较，*P<0.05，** P<0.01。图4 正清风痛宁对骨质疏松大鼠BMD的影响Fig.4 The effect of Zhengqingfengtongning on BMD of osteoporotic rats

2.5 股骨近端孔隙率

骨质疏松组大鼠股骨近端孔隙率明显高于正常对照组(P<0.05)，正清风痛宁组大鼠股骨近端孔隙率较骨质疏松组明显降低(P<0.01)，见图5。

注：与正常对照组比较，#P<0.05，## P<0.01；与骨质疏松组比较，*P<0.05，** P<0.01。图5 正清风痛宁对骨质疏松大鼠股骨近端孔隙率的影响Fig.5 The effect of Zhengqingfengtongning on the porosity of the proximal femur of rats with osteoporosis

2.6 股骨结构的病理改变

与正常对照组比较，骨质疏松组大鼠骨小梁断裂、变细、结构紊乱且数目减少。与骨质疏松组比较，正清风痛宁组大鼠骨小梁明显增粗、数量增多且结构完整，排列有序，但与空白对照组比较尚未完全恢复。见图6。

图6 正清风痛宁对骨质疏松大鼠股骨结构病理改变的影响(200×)Fig.6 Effect of Zhengqing Fengtongning on the Pathological Changes of Femoral Structure in Rats with Osteoporosis(200×)

2.7 骨组织中Nrf2、SIRT3蛋白的表达

骨质疏松组大鼠骨组织中Nrf2、SIRT3蛋白表达明显低于正常对照组(P<0.01)，正清风痛宁组大鼠骨组织中Nrf2、SIRT3蛋白表达较骨质疏松组明显升高(P<0.01)，见图7。

注：与正常对照组比较，#P<0.05，## P<0.01；与骨质疏松组比较，*P<0.05，** P<0.01。图7 正清风痛宁对骨质疏松大鼠股骨近端孔隙率的影响Fig.7 Effect of Zhengqing Fengtongning on the Porosity of Proximal Femur in Rats with Osteoporosis

3 讨论

正清风痛宁的主要成分是青藤碱，有研究[7]报道青藤碱对于胶原蛋白诱导的关节炎大鼠的骨破坏有明显改善作用，另外显示其在树突状细胞中也发挥作用，这些都表明青藤碱可能抑制骨破坏的发展程度，正清风痛宁为青藤碱中药制剂，临床广泛用于治疗各类风湿疾病，疗效较好，且不良反应小。

骨质疏松症是由于骨吸收的增加及骨形成的减少及钙磷等物质代谢失衡导致的一种全身性骨病，对人们的日常生活影响较大。诸多研究[8-11]显示氧化应激可能参与骨质疏松症的发生过程，氧化应激是由于过量活性氧产生的，会损伤成骨细胞的细胞成分，并被认为是老年性骨质疏松症中成骨细胞骨形成的关键起始因素。有研究[12]发现老年性骨质丢失与骨中氧化应激水平的逐渐增加有关。

Nrf2 是调节细胞抗氧化反应的关键转录因子，Nrf2 能同时调控成骨细胞与破骨细胞的分化和功能，参与骨代谢的过程。有报道[13]显示Nrf2 可以通过调节活性氧的信号水平诱导破骨细胞的形成。在细胞实验中也发现，在 Nrf2 缺失条件下成骨细胞系无法钙化和分化，而在破骨过程中，减少Nrf2 表达后ROS 水平明显增加，破骨细胞数量也明显增加，过表达 Nrf2后破骨细胞的数量明显减少[14]。

SIRT3 可以调控线粒体的形态功能，其特性主要表现在能够增加SOD活性，降低细胞的自由基水平，提高机体的抗氧化应激能力[15]。在骨代谢疾病中，SIRT3既能够促进成骨分化，又能够抑制破骨分化，同时延缓骨质疏松的发展。研究[16]显示，过表达SIRT3后可以通过激活SIRT3/PGC-1α/SOD2信号通路降低ROS的水平，促进干细胞的成骨分化。另一方面核因子κ B受体(RANK)及其配体的结合也会导致 SIRT3表达代偿性上调，进一步抑制破骨细胞的分化[17]。

SOD2是一种特定位于线粒体内的SOD，是一种抑制线粒体活性氧的清除酶[18]。研究发现SIRT3可以通过上调线粒体内 SOD2 的表达而提高线粒体清除活性氧能力，参与相关疾病的发生[19]。ALP 是成骨细胞的一种胞外酶，其与成骨细胞和破骨细胞的活性变化相关，是有效反映骨形成代谢的代表性指标[20]。血清降钙素是甲状腺滤泡旁细胞分泌的一种肽类激素，可以调节成骨细胞的活性而促进骨形成，同时还可以抑制破骨细胞的活性和形成，从而抑制骨的吸收[21]。

本研究结果显示，骨质疏松组大鼠血清ALP、降钙素水平及SOD2活性明显降低，MDA水平明显升高，骨密度明显降低，股骨近端孔隙率明显升高，HE染色显示骨小梁变细、断裂，结构紊乱且数量减少，骨组织中Nrf2、SIRT3蛋白表达明显降低，提示模型组大鼠存在明显的骨代谢失衡及氧化应激损伤。给予正清风痛宁治疗12周后，大鼠血清ALP、降钙素水平及SOD2活性明显升高，MDA水平明显降低，骨密度明显升高，股骨近端孔隙率明显降低，骨小梁明显增粗、排列整齐且数量明显增加，骨组织结构有明显改善，骨组织中Nrf2、SIRT3蛋白表达明显升高。说明正清风痛宁可以激活Nrf2/SIRT3/SOD2 信号通路，抑制氧化应激反应从而促进成骨分化以及抑制破骨分化，发挥缓解骨质疏松的作用。

综上所述，正清风痛宁可以明显改善醋酸泼尼松诱导的骨质疏松，其可能是通过调节Nrf2/SIRT3/SOD2 信号通路来实现的。