籽用美洲南瓜叶片对白粉病菌的抗逆生理响应

许 珂，王 萍，崔晓伟，张 颖

(内蒙古农业大学 园艺与植物保护学院，呼和浩特 010011)

籽用美洲南瓜俗称籽用西葫芦(CucurbitapepoL.)，为葫芦科(Cucurbitaceae)南瓜属(CucurbitaL.)草本植物。白粉病为籽用美洲南瓜生产中最为严重的病害之一，表现为分布广，危害时间长，整个生育期均可发病，传播速度较快，主要侵染叶片，发病严重时蔓延至茎蔓，严重影响籽用美洲南瓜产量[1]。研究表明在内蒙古地区白粉病菌为单囊壳白粉菌(Podosphaeraxanthii)，存在4个生理小种,分别为小种4、2F和1,还有1个未知的小种[2]。

有研究发现，当病原菌侵染植物时，叶片中活性氧会迸发，这被认为是植物对病原菌响应的早期防御反应之一[3]。植物与病原菌的互作可以产生过敏反应，寄主细胞受到病原菌侵染后会迅速凋亡来延缓病原菌的进一步生长[4]。李建武[5]发现，黄瓜与霜霉病的互作中产生大量活性氧，限制了病害的发生。同时活性氧可以作为信号分子存在，诱导防御基因的表达和植物对环境的适应反应[6]。同时，植物体内存在活性氧清除系统，可以在一定范围内维持活性氧的平衡。植物被病原菌侵染后，寄主体内过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)等防御酶活性发生显著变化，并认为这些酶与抗病性相关[7-9]。田丽波等[10]发现苦瓜叶片的叶绿素、POD和PPO活性与白粉病的病情指数呈显著或极显著负相关，均可作为苦瓜对白粉病抗性早期鉴定的指标。刁倩楠等[11]报道，不同甜瓜品种接种白粉病后，其抗氧化酶活性均呈先升高后降低的变化趋势，且整体升高幅度表现为抗病品种大于感病品种。

目前，对籽用美洲南瓜白粉病的研究主要集中在技术防治及抗病基因的筛选方面，而对美洲南瓜与白粉病的互作所产生的生理变化和活性氧的积累与材料抗病性之间联系的研究相对较少。故本研究选取前期筛选出的籽用美洲南瓜白粉病抗病品系及感病品系，对其接种后不同时间的叶片进行组织化学染色，观察活性氧积累以及抗氧化酶和相关物质含量的动态变化，探究其对白粉病菌的生理响应机制，为籽用美洲南瓜白粉病防治提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

试验选用高代自交的籽用美洲南瓜感病品系M3和抗病品系F2为植物材料。白粉病菌(Podosphaeraxanthii)收集于内蒙古农业大学籽用美洲南瓜种植基地田间自然发病籽用美洲南瓜叶片上的白粉病菌，经实验室前期鉴定其生理小种为2US。

1.2 方 法

1.2.1 籽用美洲南瓜白粉病菌的扩繁收集田间自然发病籽用美洲南瓜叶片上的白粉病菌,将其溶于2%的Tween-20中,制成浓度为1×106·mL-1的孢子悬浮液,喷施于籽用美洲南瓜健康植株叶片上，置于温度25～30 ℃、湿度75%～85%的拱棚中，经5次扩繁后喷施于籽用美洲南瓜植株叶片上，活体保存,用于后续试验。

1.2.2 籽用美洲南瓜与病原菌互作观察植株长至2叶1心时进行接菌，接菌后分别在 0、12、24、36、48、72、96和120 h采取叶片，利用台盼蓝染色法[12]对采集的植株幼叶样品进行处理，在COIC BK3200光照显微镜10×40倍或10×20倍下观察植物与病原菌的互作情况。

1.2.3 叶片组织化学染色分别在接种后1、3、5、7、10和15 d采集第一片真叶，用于组织化学染色观察，进行3次重复。用NBT染色[13]法检测超氧阴离子、DAB染色[13]检测H2O2的累积量。

1.2.4 抗氧化酶活性及其相关生理指标测定两叶一心时接种白粉病，取田间自然发病的叶片，经3次纯化后，采用孢子悬浮液进行接种，以喷施清水作为对照，置于人工气候箱中正常管理。分别在接种后1、3、5、7、10和15 d，随机取第一片真叶测定相关生理生化指标，3次重复, 取平均值。CAT、SOD、POD、PAL、PPO活性以及MDA、叶绿素含量的测定均参照李合生[14]的方法。

2 结果与分析

2.1 籽用美洲南瓜与白粉病病原菌的互作效应

籽用美洲南瓜感病品系M3和抗病品系F2在接种白粉病病原菌不同时间后的显微镜观察结果(图1)显示，感病品系M3在接种12 h时叶片中白粉病病原菌孢子萌发出芽管(图1，b)，接种24 h后芽管开始生长，形成短小菌丝(图1，c)，直至接种36 h白粉病病原菌生长处于菌丝生长阶段(图1，d)，接种48 h时白粉病菌丝生长出次生菌丝并持续增长(图1，e)，接种72～96 h时分生孢子梗开始萌发并持续生长形成网状菌丝体(图1，f、g)，接种120 h时分生孢子生长密集(图1，h)；而抗病品系F2在接种 0～24 h期间叶片中白粉病病原菌没有变化(图1，i-k)，在接种36 h时芽管开始萌发(图1，l)，接种48 h时芽管开始生长(图1，m)，接种72 h时芽管生长成短小菌丝(图1，n)，接种96 h时菌丝持续增长(图1，o)，接种120 h时次生菌丝产生(图1，p)。以上结果说明病原菌在感病品系叶片上发育较快，更容易侵染叶片。

2.2 白粉病菌侵染对籽用美洲南瓜叶片形态及叶绿素含量的影响

由图2可以看出，白粉病菌侵染1 d时，抗病和感病籽用美洲南瓜品系叶片均没有任何差别；接种侵染3 d时，感病品系叶片出现稀疏白斑，抗病品系叶片没有变化，且叶绿素含量没有明显差别；接种侵染5 d时，感病品系叶片白斑增多，抗病品系叶片开始出现白斑；随接种时间推移，在侵染7～10 d时，感病品系叶片可明显观察到白粉状的块斑，抗病品系叶片白斑缓慢增加，叶绿素含量开始下降；在侵染15 d时，感病品系叶片侵染白斑已经布满整个叶片，叶缘褶皱，质脆而且坚硬，逐渐变成褐黄色，叶绿素含量也明显下降，抗病品系叶片出现白粉状斑块，叶缘褶皱。

2.3 白粉病菌侵染对籽用美洲南瓜叶片和MDA含量的影响

2.4 白粉病侵染后籽用美洲南瓜叶片组织化学染色观察

a、i.接种0 h；b、j.接种12 h；c、k.接种 24 h；d、l.接种36 h；e、m.接种48 h；f、n.接种 72 h；g、o.接种 96 h；h、p.接种 120 h;M3.感病品系；F2.抗病品系；下同 图1 籽用美洲南瓜与白粉病病原菌的互作a,i. Infected for 0 h; b,j. Infected for 12 h; c,k. Infected for 24 h; d,l. Infected for 36 h; e,m. Infected for 48 h; f,n. Infected for 72 h; g,o. Infected for 96 h; h,p. Infected for 120 h; M3. Susceptible line; F2. Resistant line; The same as belowFig.1 Interaction effect between Cucurbita pepo L. and Podosphaera xanthii

H2O表示喷施清水，P. xanthii表示喷施白粉病菌悬浮液；下同图2 白粉病菌侵染后不同抗性籽用美洲南瓜叶片形态及叶绿素含量变化H2O means spraying water, P. xanthii means spraying powdery mildew suspension; The same as belowFig.2 Changes of leaf morphology and chlorophyll content of C. pepo L. with different resistance to powdery mildew

图3 白粉病侵染后不同抗性籽用美洲南瓜叶片过氧化氢、超氧阴离子及丙二醛含量的变化Fig.3 Changes of hydrogen peroxide, superoxide anion and malondialdehyde contents in leaves of C. pepo L. with different resistance after powdery mildew infection

2.5 白粉病菌侵染对籽用美洲南瓜叶片防御酶活性的影响

2.5.1 抗氧化酶活性图4显示，籽用美洲南瓜抗、感病品系植株叶片抗氧化酶CAT、SOD、POD活性在喷施清水(对照)条件下均始终无明显变化，且各抗氧化酶活性在品系间相近，而在接种白粉病菌后随着处理时间的延长均呈先增加后降低的变化趋势，且抗病品系始终明显高于同期感病品系。同时，抗病品系F2叶片各抗氧化酶活性均比感病品系M3更快达到峰值，且抗病品系酶活性增加幅度均大于感病品系。以上结果表明在受到白粉病侵染时，籽用美洲南瓜抗性品系的保护酶活性明显高于感病品系，更有利于其抑制活性氧的积累，保护植株免受侵害。

图4 白粉病侵染后籽用美洲南瓜叶片抗氧化酶活性变化Fig.4 Changes of antioxidant enzyme activities in leaves of C. pepo L.seedling after powdery mildew infection

2.5.2 PAL和PPO活性如图6所示，喷施清水处理的籽用美洲南瓜抗、感品系叶片中PAL、PPO两种酶活性在整个接种期间都没有发生明显变化，且在同期两个品系间比较接近。在接种白粉病菌初期，抗病品系PAL、PPO活性急剧增加，并于接种5 d达最大值后缓慢下降，但均明显高于同期喷施清水对照水平；而感病品系叶片PAL活性在接种初期缓慢增长，并于接种5 d达最高峰后趋于平缓，其叶片PPO活性于接种7 d达到最大值后缓慢下降。这说明籽用美洲南瓜抗病品系被白粉病侵染时诱导叶片中PAL、PPO活性的迅速增强，促进了抑菌物质的形成，有效地抑制了白粉病病原菌的增殖[22-23]，达到抵御白粉病菌进一步侵染的目的。

图5 白粉病侵染后不同抗性籽用美洲南瓜叶片组织化学染色观察Fig.5 Observation on histochemical staining of C. pepo L. leaves with different resistant seeds after powdery mildew infection

图6 白粉病菌侵染后籽用美洲南瓜叶片苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)活性的变化Fig.6 Changes of PAL and PPO activities in leaves of C. pepo L. seedling after powdery mildew infection

3 讨 论

本研究发现，在白粉病侵染籽用美洲南瓜的过程中，感病品系在接种白粉病后12 h萌发出芽管， 24 h生成短小菌丝，48 h生成次生菌丝，72～96 h分生孢子开始萌发并持续生长，120 h形成密集分生孢子，这与高启帆等[15]对白粉病侵染黄瓜的结论一致；而籽用美洲南瓜抗病品系较感病品系白粉病菌发育缓慢，于接种72 h才形成短小菌丝，120 h次生菌丝才出现。说明白粉病菌接种在不同抗性籽用美洲南瓜品系后，其生长变化与品系最初抗性具有一定关系，这与郭卫丽等[16]对白粉菌侵染南瓜的结论一致。

另外，植物正常生长发育过程中细胞内活性氧的产生和清除处于动态平衡，而逆境可以打破这种平衡状态[22]，致使过多的活性氧积累，从而对细胞膜产生毒害作用，而植物体内的SOD、POD和CAT可以使活性氧维持到正常水平[23]，且CAT、SOD、POD活性与植物抵抗病原菌侵染的能力呈正相关[24]。本研究中，喷施清水的籽用美洲南瓜抗、感品系植株叶片CAT、SOD、POD活性均无明显变化，接种白粉病的抗病植株叶片CAT、SOD和POD活性在3 d时达到最大值，而感病品种叶片CAT、SOD活性于接种5 d时达最大值，POD活性于接种7 d时达最大值。表明籽用美洲南瓜抗病品系F2叶片中的活性氧清除系统响应速度比感病品系更快，植株体内保护酶活性的高低与品系抗性有关。这与杨瑞平等[25]研究结果一致。

此外，PAL是能够促进酚类物质氧化形成木质素，而木质素可以在被侵染部位大量积累，从而抑制病原菌的繁殖[26]。PPO可以催化合成具有抗菌作用的物质，其酶活性的高低与植物的抗病性密切相关[27]。因此，PAL和PPO可以作为衡量南瓜白粉病抗性的一个指标[28]。本研究发现，在接种白粉病菌后，不同抗性籽用美洲南瓜品系叶片PPO和PAL活性在一定时期内均较对照明显升高，且抗病品系加幅度大于感病品系。说明抗病籽用美洲南瓜品系在受到白粉病菌侵染后，其体内PAL、PPO活性迅速增加以抵御病原菌的入侵，保护植株免受病原菌的侵染伤害。