贮藏温度对即食杂色蛤贮藏过程中理化特性的影响

张存存，锁 然，刘亚琼，王文秀，王浩燃，马胜涛，王 颉

（1.河北农业大学 食品科技学院,河北 保定 071001；2.石家庄邮电职业技术学院，河北 石家庄 050022）

杂色蛤（Ruditapes variegata）是我国沿海主要的贝类之一，山东青岛、福建沿海、渤海产量较多。杂色蛤可食部位营养价值高，含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物、微量元素和维生素（VA、VD、烟酰胺及VB12等）及多不饱和脂肪酸等其他营养成分，是均衡饮食的重要组成部分[1-2]。但由于杂色蛤捕捞后贮藏不当极易腐烂，可将其加工为即食产品，这不仅可以丰富贝类水产品的种类，还可以降低水产品损失率，同时满足生产者和消费者的要求。

即食杂色蛤是经反压高温杀菌处理得到的1种即食带壳原汁原味的真空软包装方便食品。产品刚加工完成时，味道鲜美，在常温条件下随着贮藏时间的延长，风味变淡，品质下降。目前关于即食水产品研究多集中在加工工艺及品质变化等方面[2-6]，而不同贮藏条件对即食杂色蛤理化指标影响的报道相对较少。本研究以即食杂色蛤为原料，研究了不同贮藏温度（-18、0、5、25和35℃）对产品的理化特性和蛋白质变化的影响，为即食杂色蛤的产后贮藏及品质控制提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

即食杂色蛤原料产地：辽宁兴城海域；即食杂色蛤由河北省秦皇岛市海东青食品有限公司提供；

试剂：TCA、EDTA、TBA、氯仿、DTNB、DNPH、盐酸胍、无水乙醇、乙酸乙酯，以上试剂均为分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；BCA蛋白定量试剂盒，北京雷根生物技术有限公司；试验用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

色彩色差计，日本柯尼卡美能达公司；TMSPRO型物性分析仪，美国FTC公司；K1100全自动凯氏定氮仪，济南海能仪器股份有限公司；酶标仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；台式高速冷冻离心机，湖南易达京华仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理 即食杂色蛤加工工艺流程：杂色蛤捕捞后立刻运往工厂，在加工车间水池暂养48 h完成吐沙，经过筛选、清洗、沥干过程后装袋，每袋为（30.0±2.0） g，真空包装，随后经金属检测后进行121 ℃，0.2 MPa的高温高压杀菌操作，待即食杂色蛤冷却后方可装箱保存。

1.3.2 色泽的测定 采用CR-400色彩色差计对即食杂色蛤蛤肉的L*、a*、b*进行测定。CIELab表色系统将颜色数值化为L*、a*和b*。按照色彩色差计使用说明进行操作，先进行白板校正，再对30个样品进行测定。

1.3.3 质构的测定 采用TMS-PRO型物性分析仪对杂色蛤腹部进行2次压缩做质构剖面分析（Texture Profile Analysis，TPA分析）。测试条件设置为：平底柱形p/5探头，测试据平面高度10 mm，测试速度30 mm/min，形变量50%，感应力0.5 N，压缩间隔时间0 s。每次对30个样品进行测定。

1.3.4 pH的测定 参照《GB 5009.237-2016食品安全国家标准 食品pH值的测定》中的酸度计法测定样品pH值。

1.3.5 TVB-N含量的测定 参考《GB 5009.228-2016 食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的半微量定氮法采用自动凯氏定氮仪测定即食杂色蛤中TVB-N含量。

1.3.6 TBA的测定 参考胡玥等[7]的方法测定样品中脂肪氧化值。

1.3.7 游离巯基值的测定 参考Morzel等[8]修改的Ellman法测定游离巯基值含量。称取2.00 g待测蛤肉，加入 10 mL 0.05 mol/L 磷酸缓冲液（pH 8.0），匀浆，3 500 r/min离心 10 min得上清液即为蛋白提取液。取1 mL上清液于试管中，稀释10倍，加20 µL 0.002 mol/L DTNB 试剂，涡旋混匀后于 25 ℃条件下避光水浴1 h，结束后于412 nm波长处测其吸光度。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白提取液中蛋白含量。试验重复3次。游离巯基值结果按式（1）计算：

式中：X为蛋白羰基值，单位为nmol羰基/mg蛋白；A为溶液吸光值；a为羰基分子吸光系数13 600 L/(mol·cm)；b为光在样本中经过的距离，单位cm，本方法中b=1；c为蛋白浓度，单位mg/mL；106为计算结果换算为nmol羰基/mg蛋白的换算系数。

1.3.8 蛋白羰基值的测定 参考Mercier Y等[9]和胡吕霖[9]的方法稍作修改。采用DNPH比色法测定即食杂色蛤中蛋白羰基值。准确称取2.00 g待测蛤肉，加入 10 mL 0.02 mol/L 磷酸缓冲液（pH 6.5）（含 0.6 mol/L 的 NaCl），匀浆，13 000 r/min 离心10 min得上清液即为蛋白提取液。

取 400 µL 上清液于 EP 管中，加 200 µL 2 mol/L的 HCl（含 0.01 mol/L DNPH），涡旋混匀，30 ℃避光水浴1 h（每10 min 涡旋1次）。结束后向EP管内加入1 mL 40%的TCA，涡旋混匀静置30 min沉淀蛋白。随后 13 000 r/min 离心 15 min，留沉淀，再加入1 mL体积比为1∶1的乙酸乙酯和乙醇溶液，涡旋，13 000 r/min 离心 10 min，以除去多余的DNPH，多次重复洗涤沉至上清液为无色。取沉淀加3 mL 6 mol/L盐酸胍溶液，涡旋以溶解蛋白。待沉淀完全溶解后于370 nm波长处测其吸光度。蛋白羰基值结果按式（2）计算：

式中：X为蛋白羰基值，单位为nmol羰基/mg蛋白；A为溶液吸光值；a为羰基分子吸光系数22 000 L/(mol·cm)；b为光在样本中经过的距离，单位cm，本方法中b=1；c为蛋白浓度，单位mg/mL；106为计算结果换算为nmol巯基/mg蛋白的换算系数。

1.4 试验设计

将即食杂色蛤设 -18、0、5、25和 35 ℃ 5个温度进行贮藏，其中-18 ℃处理每30 d，0、5和25 ℃处理每 15 d，35 ℃处理每 10 d 取样进行色泽、质构、pH、TVB-N含量、TBA、游离巯基值和蛋白羰基值进行测定，试验重复3次。

1.5 试验结果统计分析方法

采用SPSS 25（IBM）对数据进行统计分析和方差分析，P< 0.05时为显著性差异。采用Origin 2018版软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 色泽变化分析

色泽在产品的外观和接受度中起着重要作用，直接影响着消费者对产品的喜好程度。一般来说，在产品中贮藏过程中，由于蛋白的氧化变性、脂质氧化和色素降解过程都会造成颜色发生变化。即食杂色蛤贮藏过程中色泽L*、a*和b*变化如图1所示。

图1 即食杂色蛤贮藏过程中L＊、a＊和b＊变化Fig. 1 Changes of L＊、a＊ and b＊ in ready-to-eat variegated clams during storage

即食杂色蛤贮藏过程中色泽L*变化如图1(a)所示，从图可见，与-18 ℃冻藏组相比，0、5、25和35 ℃ 4个温度L*显著下降，且35 ℃贮藏下变暗速度最快，25、5和0 ℃次之，-18 ℃最慢，表明即食杂色蛤在高温贮藏下，颜色变化更加显著，Li等[11]发现即食对虾在贮藏过程中L*下降，这与本研究的结果相似。这表明较高的贮藏温度会加速杂色蛤自身的褐变。随贮藏时间的延长，肌肉中的脂质氧化物、蛋白发生非酶促褐变以及氧化反应均会导致变色，使L* 值下降[12]。

从图1(b)，即食杂色蛤红绿值在整个贮藏过程中整体呈先上升后下降的趋势，其中35 ℃贮藏变化最为明显。经差异性分析，-18和0 ℃两组之间没有显著性差异，其他温度组之间均存在显著性差异（P< 0.01）。即食杂色蛤贮藏过程中，肌红蛋白发生变性，亚铁肌红蛋白变成高铁肌红蛋白，使即食杂色蛤在贮藏后期红度值降低[13]。

从图1(c)可见，即食杂色蛤b*整体呈先下降后平稳趋势。在5个贮藏温度结束时，25和35 ℃与其他3个温度之间存在显著性差异（P< 0.05），-18、0和5 ℃ 3个贮藏温度之间无明显差异。黄色色素的形成可能是由于脂质氧化产物与磷脂中的胺或蛋白质中的胺发生非酶褐变[12]。

综合L*、a*、b* 3个色泽指标变化表明即食杂色蛤随贮藏时间的延长，L*逐渐减小，a*在贮藏后期逐渐减小，b*在贮藏后期值逐渐增大，即食杂色蛤的颜色由乳白色变为棕黄色，发生劣变。

2.2 质构变化分析

水产品的质地是评价其品质好坏的重要指标之一，直接影响水产品的口感。贮藏期间产品的质构受诸多因素影响，例如加工方式[10,14-15]、干制[16-17]及氧化反应[14,18]等。

硬度可以反应产品内部结构的紧密程度。即食杂色蛤贮藏过程中硬度变化如图2(a)所示，整体呈现先上升后下降的趋势，蛋白聚集可能会导致硬度上升，随贮藏时间延长内源作用导致蛋白质降解、肌肉结构松散，从而使硬度又呈下降趋势。-18 ℃冻藏和35℃高温贮藏2组变化最为显著，由3.70 N分别降至1.75和3.12 N，这可能是因为冷冻或高温使蛋白质发生变性或聚集作用，影响蛋白质结构，从而影响即食杂色蛤的硬度。

图2 即食杂色蛤贮藏过程中硬度和弹性变化Fig. 2 Changes of hardness and elasticity in ready-to-eat variegated clams during storage

即食杂色蛤贮藏过程中弹性变化如图2(b)所示，所有贮藏温度下弹性均随时间延长弹性呈下降的趋势，贮藏结束各组之间差异不显著。即食杂色蛤贮藏初始弹性为1.874 mm，贮藏结束时分别为0.932 mm（-18 ℃ -180 d）、1.22 mm（0 ℃ -180 d）、1.18 mm（5 ℃ -180 d）、1.04 mm（25 ℃ -180 d）和 1.01 mm（35 ℃-90 d）。即食杂色蛤在0和5 ℃变化趋势相对平缓，在-18和35 ℃贮藏的即食杂色蛤弹性下降比较迅速。所有温度贮藏前后弹性均存在显著差异性（P< 0.05），说明温度对即食杂色蛤贮藏弹性有一定影响。

咀嚼性表示产品咀嚼到可以吞咽状态时所做的功，可以反应产品的新鲜度，咀嚼性降低表明肌肉纤维丧失了其完整性，导致了肌肉间韧性的弱化[14]。即食杂色蛤贮藏过程中咀嚼性变化如表1所示，从表中可以看出，所有贮藏方式下咀嚼性均呈现下降趋势，但贮藏前后差异性略有不同。5个贮藏温度相比，0和5 ℃贮藏组咀嚼性下降相对其他贮藏组较为缓慢，经过180 d贮藏前后样品咀嚼性并无显著性差异，而-18 ℃贮藏组样品贮藏前后咀嚼性则存在极显著差异（P< 0.01），表明即食杂色蛤适宜在冷藏条件（0～5 ℃）下贮藏能更好的保持产品咀嚼性。综合以上3个质构指标，表明即食杂色蛤适宜在冷藏条件（0～5 ℃）下贮藏，可更好的保持产品原本质构特性。

表1 即食杂色蛤贮藏过程中咀嚼性变化Table 1 Changes of chewability in ready-to-eat variegated clams during storage

2.3 pH变化分析

水产品肌肉pH值的变化与其新鲜度密切相关，pH变化受诸多因素影响，如贮藏时间、贮藏温度及本身的生理状态等。即食杂色蛤贮藏过程中pH变化如图3所示。从图3可见，即食杂色蛤在贮藏过程中pH值在6.79～7.49范围内，除-18 ℃贮藏组外整体呈先上升后下降趋势。35 ℃贮藏组最高pH值高于其他组，且达到最高pH值时间比其他组短，为30 d。使pH值变化的主要原因是贮藏期间内源酶作用蛋白质降解产生碱类化合物使pH上升，后期肌肉中的糖原发生无氧酵解而积累更多的乳酸，从而使pH的下降[19]。-18 ℃贮藏组在整个过程呈现缓慢下降趋势，但贮藏前后不存在显著性差异。

图3 即食杂色蛤贮藏过程中pH变化Fig. 3 Changes of pH in ready-to-eat variegated clams during storage

2.4 TVB-N含量变化分析

挥发性盐基氮（TNB-N）通常作为评价肉质新鲜与否的重要指标，其含量越低，表明产品新鲜度越高。即食杂色蛤在不同温度贮藏过程中TVB-N含量变化如图4所示。从图4可见，所有处理组的TVB-N含量变化均呈上升趋势，且以35 ℃处理组上升速率最快，-18 ℃冻藏组最为缓慢。即食杂色蛤TVB-N含量初始值为1.39 mg/100 g，贮藏180 d 结束时 TVB-N 含量分别上升到 4.62 mg/100 g（-18 ℃）、8.39 mg/100 g（0 ℃）、10.29 mg/100 g（5 ℃）和 10.29 mg/100 g（25 ℃），35 ℃ 贮 藏90 d 升至 12.35 mg/100 g，经差异性分析得，5 和25 ℃2个贮藏温度之间无差异，与其他3个温度之间均存在显著性差异（P< 0.01）。由此可以看出，-18 ℃冻藏可减缓TVB-N含量的变化，贮藏即食杂色蛤效果较好。挥发性盐基氮升高的原因是由于酶的分解作用使产品蛋白质发生分解产生了含氨、氮和硫等挥发性物质。即食杂色蛤在-18、0和5 ℃温度下贮藏30 d与初始品质差异不显著，与GB 2733-2015 限值 30 mg/100 g 相比，即食杂色蛤在 -18、0、5 和 25 ℃贮藏 180 d，在 35 ℃贮藏 90 d时均未超标，仍可安全食用。

图4 即食杂色蛤贮藏过程中TVB-N含量变化Fig. 4 Changes of TVB-N content in ready-to-eat variegated clams during storage

2.5 TBA变化分析

硫代巴比妥酸值（TBA）与肉类脂肪氧化程度有很强的相关性。TBA值越大，说明脂肪的氧化程度越高，产生的小分子物质（醛、酮、酸等）也就越多，脂肪酸败就越严重，因此广泛用于肉产品品质评价中反应脂类氧化的常用指标。

即食杂色蛤在整个贮藏过程中硫代巴比妥酸（TBA）值变化如图5所示。从图5可见，TBA值均随贮藏时间延长呈上升趋势，本研究结果变化趋势与之前研究结果[20]相似。即食杂色蛤贮藏开始时 TBA 值为 1.564 mgMDA/100 g，贮藏 180 d 结束时，-18、0、5和25 ℃贮藏条件下分别上升至2.212、5.850、6.210 和 7.237 mgMDA/100 g，35 ℃贮藏到90 d 时上升至 9.913 mgMDA/100 g，由此可以看出，0和5 ℃贮藏没有显著差异，但与其他3个温度均存在显著性差异（P< 0.05），35 ℃贮藏即食杂色蛤脂肪氧化最为迅速，-18 ℃冻藏可减缓TBA的变化速率，可有效减缓脂肪氧化速率。TBA随贮藏时间延长而升高的原因可能是前期加工过程和后期贮藏期间细胞结构被破坏，使不饱和脂肪酸氧化产生的丙二醛含量增加，从而TBA增加。另外，即食杂色蛤富含多不饱和脂肪酸和矿物质，更容易发生脂质过氧化从而导致产品品质下降[21]。

图5 即食杂色蛤贮藏过程中硫代巴比妥酸值变化Fig. 5 Changes of TBA value in ready-to-eat variegated clams during storage

2.6 游离巯基值变化分析

游离巯基值多用于反应蛋白氧化程度，巯基含量越低，说明蛋白氧化程度越高。即食杂色蛤贮藏过程中游离巯基值变化如图6所示，整体呈下降趋势，但0、5和25 ℃贮藏组30 d前呈上升趋势，而随后呈下降趋势。即食杂色蛤初始游离巯基值为24.26 nmol巯基 /mg蛋白，贮藏 180 d结束时，其值分别降至21.75 nmol巯基/mg蛋白（-18 ℃）、17.69 nmol巯基 /mg 蛋白（0 ℃）、16.68 nmol巯基 /mg蛋白（5 ℃）和 16.37 nmol巯基 /mg蛋白（25℃），35 ℃贮藏到90 d降至13.65 nmol巯基/mg蛋白，分别下降了10.35%、27.08%、31.24%、32.52%和43.73%。35 ℃贮藏组均与其他温度组存在显著差异性（P< 0.01），180 d 贮藏结束时，0、5 和 25 ℃3个贮藏组差异性不显著，但均与-18 ℃贮藏组存在显著性差异（P< 0.01）。

图6 即食杂色蛤贮藏过程中游离巯基值变化Fig. 6 Changes of free sulfhydryl value in ready-to-eat variegated clams during storage

即食杂色蛤在0、5和25贮藏到30 d时，游离巯基值均达到最大值，随后又呈下降趋势，导致最大值出现的原因可能是因为含硫氨基酸（半胱氨酸与甲硫氨酸）经自由基氧化反应生成多种氧化产物（如二硫键交联产物），二硫键断裂导致巯基含量增高[22]，而后随贮藏时间延长巯基则又氧化导致含量下降[10]。5个贮藏温度相比，-18 ℃冻藏组更能减小即食杂色蛤贮藏过程中的蛋白氧化程度。

2.7 蛋白羰基值变化分析

蛋白羰基化是蛋白氧化的显著特征之一。本试验采用传统的2，4-二硝基苯肼（DNPH）法测定即食杂色蛤蛤肉中蛋白羰基值。即食杂色蛤贮藏过程中蛋白羰基值变化如图7所示，从图7可见，即食杂色蛤在贮藏过程中均呈上升趋势，但不同贮藏温度蛋白羰基值变化有所不同，说明不同温度贮藏过程中，蛋白也发生了不同程度的氧化，且贮藏温度越低，蛋白氧化程度越低。最初蛋白羰基值为3.188 nmol羰基/mg蛋白，贮藏180 d结束时其值分别为 3.550 nmol羰基 /mg 蛋白（-18 ℃）、6.093 nmol羰基/mg蛋白（0 ℃）、7.149 nmol羰基/mg蛋白（5 ℃）、8.164 nmol羰基 /mg 蛋白（25 ℃），而35 ℃贮藏 90 d 则上升至 6.042 nmol羰基 /mg 蛋白，此值升高原因可能是由于肌肉组织破裂的细胞器释放了氧化酶和氧化剂导致，这些过程通常与肌肉蛋白质功能的下降有关，导致水分流失增加，蛋白质凝胶变弱，另一方面可能是由于含侧链残基的氨基酸（如赖氨酸、精氨酸、苏氨酸与脯氨酸等）存在，其被氧化而引入羰基基团[10]。从此指标可以看出，温度越低，蛋白氧化程度越小，越有利于即食杂色蛤的贮藏。

图7 即食杂色蛤贮藏过程中蛋白羰基值变化Fig. 7 Changes of protein carbonyl value in ready-to-eat variegated clams during storage

3 结果与讨论

通过测定即食杂色蛤在不同温度（-18、0、5、25和35 ℃）下贮藏期间理化特性变化，发现5个温度下贮藏前后各指标均存在显著性差异，随贮藏时间延长，即食杂色蛤L*、弹性和咀嚼性呈下降趋势，TVB-N含量、TBA和菌落总数呈上升趋势，a*、硬度和pH呈先上升后下降趋势，b*则先下降后趋于平稳，即食杂色蛤各指标在贮藏前后均存在显著性差异。以TVB-N含量为评价指标，即食杂色蛤在-18、0和5 ℃温度下贮藏30 d与初始品质差异不显著，考虑其安全性在-18、0、5和25 ℃贮藏180 d，在35 ℃贮藏90 d时均未超标，仍可安全食用。这不仅为即食杂色蛤加工贮藏提供了理论依据和数据支撑，同时也为开发新的即食水产品奠定了基础。