ATP生物荧光增幅法在食品微生物 污染检测中的应用

魏姣姣，黄喜海

（浙江华才检测技术有限公司，浙江诸暨 311800）

食品安全问题的来源是多方面的，不仅包括原料质量、加工技术、生产环境，更主要的是对其的保管与储存[1]。对于部分特殊的食品，微生物污染是主要影响产品质量的因素，而出现微生物污染的环节也是多样性的，从原材料的产出到产品销售，中间的任意环节都有可能出现微生物污染[2]。在食品被污染的前期，并不会在外观上表现出明显的变化，但食品本身很可能已经变质，如果不能及时检出，在市面上被销售，极有可能产生严重的食品安全问题[3]。传统的微生物检测主要是对检测物品进行微生物培养，不仅对检测操作的要求较高，检测周期也相对较长，这与现阶段快节奏的生活方式并不契合，且其检测结果也具有一定的失准性，效果并不理想[4]。ATP生物荧光增幅法作为近些年来逐渐被关注的微生物检测方法，不但具有较高的检测效率，同时操作更加便捷，在检测领域得到了广泛应用。

基于此，本文提出基于ATP生物荧光增幅法的食品微生物污染检测方法。使用ATP荧光对营养物质进行标记，通过统计培养过后ATP荧光的增幅判断食品中是否存在微生物污染，通过实验验证了该方法的有效性，以期为食品的微生物污染检测提供有价值的参考。

1 食品微生物污染检测

1.1 荧光染色标记

在传统的食品微生物检测中，主要是通过对样本进行细菌培养的方式判定其是否被污染，通过培养结果分析微生物存在的可能性，结果的可靠性相对较低[5]。本文将ATP生物荧光增幅法应用于微生物污染检测中。

对营养物质进行荧光标记，一般情况下，当食品中出现微生物污染时，随着微生物的衍生，其需要不断吸取食品中的营养物质作为其生存的基础，此时的食品可以理解为是微生物的营养基，本文利用这一特点，在使用中加入包含荧光剂成分的高浓度营养物质。当食品中有微生物时，可以通过显微观察发现移动的荧光，由于营养液自身也是非静态的，直接统计的结果存在一定偏差，利用动态荧光的增加程度，可以实现对微生物数量的准确判断。需要注意的是，在对营养物质进行荧光染色时，要避免荧光在食品表面的印染，当其对食品本身产生染色作用时，会影响最终的统计结果，因此，本文选用ATP作为染色材料。

1.2 ATP荧光增幅分析

ATP生物荧光增幅检测法本质上是利用了微生物的生存需求和繁衍的基本原理，在完成对营养物质的标记后，在（37.5±0.5）℃的温度环境中，培养2 h，再使用冲洗液对其表面进行冲洗，此时需要注意冲洗的力度不应过大，否则会造成含有ATP荧光的微生物被全部冲走，无法进行后续的检测工作。冲洗完成的待检食品需要在相对湿度为（60±5）%的环境中静置10 min直至其表面处于干燥状态。此时通过显微镜观察食品表面是否存在ATP荧光成分，如果不存在，则表明食品不存在微生物污染，如果存在，记录观察到的微生物数量。完成后再重新将其置于（37.5±0.5）℃的温度环境培养2 h。完成后重复上面的操作，冲洗、晾干，再次在显微环境下观察ATP荧光的数量，统计其实际增量。如果ATP荧光的数量未出现变化，同样表明检测食品没有出现微生物污染的情况，如果出现明显的增幅，则表明存在微生物。结合其增幅与时间的关系，推断微生物的总量。本文将ATP荧光增幅作为最终检测结果的判定依据，避免了盐、其他化学物质和游离态在食品中的干扰，使检测结果具有更高的准确性。

2 应用测试

对本文提出的微生物检测方法进行实际应用测试。并将文献[2]和文献[3]提出的检测方法作为对照组，通过对比3种方法的检测结果，分析本文方法的效果。

2.1 样本设置

本文将复苏的HFSCs细胞在DM EM／F12培养基中悬浮培养，共分为3组，另外取3个DM EM／F12培养基，进行枯草芽孢杆菌的培养，白假丝酵母菌的培养，同样将其置于分别接种到DM EM／F12培养基中，并将其置于温度为（37.5±0.5）℃，相对湿度为（60±5）%的环境中，时间为2 h。最后取3个DM EM ／F12培养基，直接置于温度为（37.5±0.5）℃，相对湿度为（60±5）%的环境中培养2 h，将其作为阴性对照组。

2.2 实验过程

选择典型支原体污染试验样本作为阳性对照。含 HFSCs玻片在不含抗生素的培养基中培养2 d后，吸取培养液，用PBS冲洗，用冷空气干燥，用固定液固定5 min。将制备的ATP Hoechst3342工作染料添加到固定细胞中，并在室温下染色30 min，染色的盖玻片用PBS浸泡3次，每次3 min，用冷空气干燥，含1%甘油的PBS覆盖在细胞表面。密封处理后，干燥，观察细胞核周围是否产生ATP荧光。

2.3 检测结果

在上述基础上，对比3种方法对不同培养基的检测结果，具体如表1所示。廖燮恒等[2]和白淼等[3]的方法均未实现对HFSCs的有效检出，同时，廖燮恒等[2]方法对白假丝酵母菌的检出不明显，白淼等[3]的方法对枯草芽孢杆菌的检出方法不明显。相比之下，本文方法实现了对4组样品的准确检出，检测结果更加可靠。

表1 不同方法的微生物检测结果

3 结论

随着食品加工行业的蓬勃发展，对食品质量控制的重要性也越来越受到重视，其中微生物污染检测作为一项难度较高，流程较为复杂的检测环节，一直是产品质量控制的重要方式。而微生物污染前期，食物外观上的表现并不明显，对其检测也更加困难。本文提出的基于ATP生物荧光增幅法的食品微生物污染检测方法，并实现了对微生物的准确检出。通过本文的研究，以期为食品安全检测工作提供有价值的帮助。