斑地锦黄烷酮-3-羟化酶基因及启动子的克隆与分析

钟小菊，吴晴阳，张永康，饶泽昌，王 飞，黄胜和*

(1 江西中医药高等专科学校 医学基础部，江西抚州 344000；2 南昌大学 抚州医学院，江西抚州 344000)

斑地锦(EuphorbiamaculataL.)是一年生大戟科(Euphorbiaceae)大戟属(EuphorbiaL.)草本植物，分布于江西、新疆、河南和浙江等地区[1]，具有清热解毒、利湿退黄、凉血止血等功效，主治痢疾、泄泻、尿血、便血、疮疖痈肿、湿热黄疸等[2]。斑地锦主要含有黄酮类、萜类、酚酸类和生物碱类等成分，其中槲皮素是主要药效成分之一[3]。目前，斑地锦研究主要集中在成分分离、药用价值以及临床应用等方面[4-5]，分子生物学相关研究报道较少。

槲皮素属于黄酮类化合物，其生物合成经由苯丙烷代谢途径，而黄烷酮-3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase，F3H)是苯丙烷代谢途径的关键酶之一，催化柚皮素(naringenin)生成二氢山奈酚(dihydrokaempfero，DHK)。DHK是合成黄酮醇和花青素的重要中间物质，阻断F3H基因的表达，可导致拟南芥植株体内黄酮及花色素等含量变低[6]。目前，F3H基因已在金鱼草(AntirrhinummajusL.)[7]、丹参(Salviamiltiorrhiza)[8]和白芨(Bletillastriata)[9]等多种植物[10]中被克隆，但斑地锦F3H基因克隆还未见报道。该实验根据已知的植物F3H基因进行序列比对，在高度保守区设计简并引物，PCR法结合RACE技术、热不对称PCR(Tail-PCR)[11]克隆斑地锦F3H基因及其启动子，利用qRT-PCR技术检测在苗期、花期和果期不同组织中的表达情况，为进一步研究斑地锦F3H基因表达调控和完善斑地锦槲皮素生物合成途径提供便利条件。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验植株采集于江西中医药高等专科学校实验田，经江西中医药高等专科学校药学系中药教研室鉴定为斑地锦(EuphorbiamaculataL.)。分别采集苗期(未开花)、花期(开3朵以上的花且未结果)和果期(结3个以上的果)等的根、茎、叶以及果期的果实，样品采集后立即置-80 ℃冰箱备用。

1.2 主要试剂与仪器

植物总RNA提取试剂盒(Spin Column Plant Total RNA Purification Kit)、基因组DNA抽提试剂盒(Spin Column Plant Genomic DNA Purification Kit)、质粒DNA小量抽提试剂盒(SanPrep柱式)、胶回收试剂盒(SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit)、引物合成、测序等，生工生物工程(上海)股份有限公司；反转录试剂盒(PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser)、荧光定量PCR试剂盒(PrimeScript RT Master Mix)等，宝日医生物技术(北京)有限公司；Pfu酶(TransStart FastPfu DNA Polymerase)、Taq酶、Marker(Trans2K®Plus Ⅱ DNA Marker)、T-载体(pEASY-Blunt Simple Cloning Kit)等，北京全式金生物技术有限公司。该实验所用引物见表1。

表1 实验所使用的引物

普通PCR仪(S1000TMThermal Cycler)、荧光定量PCR仪(CFX96 Real-Time)等，美国Bio-Rad公司；超微量分光光度计(NanoDrop One)，美国Thermo Scientific公司。

1.3 实验方法

1.3.1 总RNA提取、cDNA合成和DNA的提取斑地锦总RNA提取、DNA提取和cDNA合成均按试剂盒说明书进行。总RNA提取后经1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，超微量分光光度计测定RNA浓度。

1.3.2F3H基因片段的获得在GenBank中查找麻风树(JatrophacurcasL.)、非洲菊(GerberajamesoniiBolus)和乌桕(Triadicasebifera)等植物的F3H基因序列，比对找出高度保守区，Primer Premier5.0软件设计简并引物F3H-ZF和F3H-ZR，以引物FZL-1对总RNA反转录得到的cDNA为模板，PCR扩增斑地锦F3H基因保守序列。反应体系(25 μL)：5×GC缓冲液5 μL，dNTPs 2 μL，F3H-ZF、F3H-ZR各2 μL，cDNA模板2 μL，Pfu酶0.3 μL，灭菌超纯水11.7 μL。反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物电泳后胶回收试剂盒回收，连T-载体，转化大肠杆菌DH5α感受态，菌液PCR筛选阳性后送测序。

1.3.3F3H基因ORF区的获得根据保守序列测序结果设计正向特异引物F3H-XF，根据反转录引物FZL-1设计反向引物F3H-3R，进行3′-RACE。反应体系(25 μL)：5×GC缓冲液5 μL，dNTPs 2 μL，F3H-XF、F3H-3R各1 μL，cDNA模板1 μL，Pfu酶0.3 μL，灭菌超纯水14.7 μL。反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物电泳后胶回收测序。

根据保守序列测序结果设计特异引物F3H-

SR1、F3H-SR2、F3H-SR3，与随机引物ADF1/ADF2/ADF3/ADF4，以及引物ADF0进行Tail-PCR扩增F3H基因5′端。Tail-PCR第一轮PCR，反应体系(25 μL)：10×缓冲液2.5 μL，dNTPs 2 μL，ADF1(/ADF2/ADF3/ADF4)2 μL，F3H-SR1 1 μL，基因组DNA模板1 μL，Taq酶0.3 μL，灭菌超纯水16.2 μL。第二轮PCR反应体系(25 μL)：10×缓冲液2.5 μL，dNTPs 2 μL，ADF0、F3H-SR2各1 μL，稀释100倍的第一轮PCR产物1 μL，Taq酶0.3 μL，灭菌超纯水17.2 μL。第三轮PCR反应体系(25 μL)：10×缓冲液2.5 μL，dNTPs 2 μL，ADF0、F3H-SR3各1 μL，稀释100倍的第二轮PCR产物1 μL，Taq酶0.3 μL，灭菌超纯水17.2 μL。Tail-PCR反应程序见文献[11]。根据第二轮和第三轮PCR产物电泳结果选择长度合适的条带进行胶回收测序。

将所获得的F3H保守序列、5′端序列和3′端序列用DNAstar软件拼接，结合GenBank中的blast结果，获得ORF区序列，设计特异引物F3H-CF、F3H-CR，用Pfu酶进行PCR扩增并送测序。

1.3.4 生物信息学分析F3H蛋白的理化性质预测采用ExPASy Proteomics Server提供的在线工具Protparam (https://web.expasy.org/protparam/)，NCBI的 conserved domain database(https://www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)预测蛋白保守结构域。TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)进行跨膜结构域预测，Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)进行结构域三维建模[12]，NCBI中的Distance tree of results(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行系统进化树分析。

1.3.5F3H基因不同生长期组织表达差异分析根据F3H基因ORF区序列设计荧光定量PCR引物F3H-qF、F3H-qR，分别提取斑地锦苗期、花期和果期的根、茎、叶以及果实的总RNA，经琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计检测后，反转录试剂盒合成cDNA，以UBQ为内参基因[13]，进行荧光定量PCR扩增。反应体系(20 μL)：2×TB Green Premix Ex Taq(TliRNaseH Plus)10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，灭菌水7.2 μL；扩增条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；每个反应体系重复3次。利用Excel分析处理实验结果。

1.3.6F3H基因启动子序列的获得与分析根据5′端序列设计特异引物F3H-SR4、F3H-SR5、F3H-SR6，以基因组DNA为模板，采用Tail-PCR进行染色体步移，扩增EmF3H基因的启动子，反应体系和反应程序与1.3.3相同。根据Tail-PCR产物测序结果设计特异引物F3H-PF、F3H-PR，用Pfu酶进行PCR扩增并送测序。序列分别用Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE(https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace)分析序列特征。

2 结果与分析

2.1 斑地锦F3H基因的克隆

试剂盒提取斑地锦总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测质量良好(图1)。由图1可知，同源克隆法设计简并引物F3H-ZF和F3H-ZR，PCR获得预期510 bp左右的斑地锦F3H基因保守序列，3′-RACE法得到约530 bp的3′端序列；Tail-PCR进行染色体步移，第三轮产物比第二轮产物小120 bp左右，将第三轮产物测序获得保守序列上游约2 000 bp，其中包含基因5′端序列；将保守序列、3′端序列、5′端序列用DNASTAR软件进行组装，根据组装结果设计特异引物F3H-CF和F3H-CR扩增ORF区。测序结果显示，斑地锦F3H基因ORF区包含1 092 bp，编码364个氨基酸，其中氨基酸序列与油桐(Verniciafordii)、乌桕(Triadicasebifera)的序列相似性高达85.5%、85.4%。将此基因命名为EmF3H， GenBank登录号为MW767838。

M. Trans2K® Plus Ⅱ；1.总RNA；2.保守序列；3.3′-RACE；4-5.5′-Tail第二、三轮产物；6.ORF 图1 EmF3H基因的克隆M. Trans2K® Plus Ⅱ; 1. Total RNA; 2. Conserved sequence; 3. 3′-RACE; 4-5. The second and third round products of 5′-Tail-PCR; 6. ORFFig.1 Cloning of EmF3H

2.2 EmF3H的生物信息学分析

用在线工具Protparam分析斑地锦F3H蛋白的理化性质，等电点(pI)为5.47，相对分子质量为40.93 KDa，不稳定系数47.89，脂肪指数为86.54，平均亲水性为-0.371，表明EmF3H为相对稳定的疏水性蛋白。保守结构域预测显示该蛋白属于2-酮戊二酸铁依赖的双加氧酶(2-oxoglutarate/iron-dependent dioxygenase，2-ODD)超家族，与其他植物F3H的保守结构域相似。TMHMM 2.0预测EmF3H不含跨膜区域。Phyre三维建模结果见图2，以克拉维胺合成酶(Clavaminate synthase，PDB ID：d1gp6a)的晶体三维结构为模板建模，三维模型覆盖率为91%，序列的一致性为31%。利用NCBI在线BLAST工具将F3H 与GenBank 中其他植物F3H蛋白进行比对，选择相似性最高的17种F3H蛋白，用Distance tree of results中的Neighbor Joining法构建系统进化树(图3)，不同物种来源的F3H蛋白在进化上归属不同的分支，类似于蔓花生、大花悬铃果的F3H，EmF3H也为相对独立的一个分支。

图2 EmF3H蛋白三维结构预测Fig.2 The deduced three-dimensional structure of EmF3H

图3 EmF3H和其他F3H蛋白的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree analysis of EmF3H protein and other plant F3H proteins

2.3 EmF3H基因在不同生长期组织表达模式

分别提取斑地锦不同生长期(苗期、花期、果期)根、茎、叶、果的总RNA，以UBQ为内参基因，进行qRT-PCR扩增。结果显示，EmF3H在不同生长期各组织中均有表达，但表达量有显著差异，其中花期的根和果期的果实中表达量最高，其次为苗期的根和果期的根、茎，在各生长期的叶、苗期的茎和花期的茎内表达水平较低(图4)。另外，在茎中随生长期表达有不断增强的趋势，在根内表达量先上调后下降。

2.4 EmF3H基因启动子序列的获得与分析

以斑地锦基因组DNA为模板，Tail-PCR法进行染色体步移(图5)，将第三轮约2 000 bp的PCR产物胶回收后连接T-载体测序。根据测序结果设计特异引物F3H-PF、F3H-PR，Pfu酶进行PCR扩增并送测序，结果获得约1 604 bp的EmF3H启动子序列，用Plantcare和PLACE分析显示内含TATA-box、CAAT-box等基本启动子序列，也含有Box 4(ATTAAT)、G-Box(CACGTG)、GATA-motif(AAGATAAGATT)、AE-box(AGAAACAA)、I-box(TGATAATGT)、TCT-motif(TCTTAC)等光反应元件，LTR(CCGAAA)低温反应元件，TC-rich repeats(GTTTTCTTAC)应激反应元件，circadian(CAAAGATATC)昼夜节律调控元件和ABRE(ABA反应元件)、P-box(GAs反应元件)、TGA-element(生长素反应元件)等激素反应元件。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)图4 不同生长期不同组织中EmF3H的相对表达量Different normal letters indicate significant difference at 0.05 level (P<0.05)Fig.4 The relative expression levels of EmF3H from different tissues in different growth stages

M. Trans2K® Plus Ⅱ；1.启动子；2-3.Tail-PCR第二、三轮产物图5 EmF3H基因启动子的克隆M. Trans2K® Plus Ⅱ; 1. EmF3H promoter; 2-3. The second and third rounds products of Tail-PCRFig.5 Cloning of EmF3H promoter

3 讨 论

苯丙烷代谢途径是植物重要的次生代谢途径之一，该途径以苯丙氨酸为底物，先后在苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)、4-香豆酰-CoA连接酶(4CL)、查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮-3-羟化酶(F3H)、类黄酮-3′-羟化酶(F3′H)、黄酮醇合成酶(FLS)等一系列酶的催化作用下，合成黄酮类、木质素及花青素等多种次生代谢产物[14-15]，而F3H是其中的关键酶之一，催化柚皮素生成二氢山奈酚。F3H的克隆与功能研究已有一些报道[7-10]，烟草中超表达枸杞LcF3H提高了黄烷-3-醇的含量和对干旱胁迫的耐受性[16]；转基因高粱胚轴中，SbF3H将部分碳流转移到了3-羟基黄酮的生产上[17]。

该研究从斑地锦中克隆了一个F3H基因编码区及其启动子。蛋白质EmF3H与油桐VfF3H、乌桕TsF3H的序列相似性分别为85.5%、85.4%，初步证明EmF3H属于F3H基因家族，氨基酸序列聚类分析结果表明其为相对独立的一个分支，说明EmF3H在进化上有明显的种属特性。研究表明F3H基因在不同植物不同生长期和不同组织中表达水平有差异，柠条锦鸡儿CkF3H在根、茎和叶中均有表达，没有组织特异性[18]，而茶菊CmF3H在花中表达量最高，其次为茎、叶，根中表达量最低[10]；EmF3H在花期的根和果期的果实中表达量最高，随着植物的生长，表达量在茎中逐渐上升，在叶内一直较低，说明该基因表达在斑地锦中存在组织特异性，同时预示着F3H可能参与多种物质的生物合成，且在不同植物中功能侧重点不同，其具体功能有待于进一步挖掘。在EmF3H启动子序列内预测有TAAT-box等基本启动子序列和光反应元件、应激反应元件、激素反应元件等，表明EmF3H可能参与胁迫应答，但是否能够响应不同胁迫，进而影响槲皮素等黄酮类化合物的合成，还需进一步研究基因表达调控。因此，该研究结果丰富了F3H基因资源，也对探讨斑地锦苯丙烷类次生代谢途径(包括黄酮类化合物生物合成途径)奠定了一定的基础。