土壤中草甘膦检测方法研究进展

朱 娜，元相虎，张宇竞，张 浩

（吉林省生态环境监测中心，吉林 长春130011）

草甘膦（Glyphosate，Gly）化学名称N-磷酰基甲基甘氨酸，是由美国孟山都公司开发的除草剂，又称镇草宁、农达（Roundup）、草干膦、膦甘酸。草甘膦是一种内吸传导型非选择性广谱除草剂，主要通过抑制植物体内的烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶，从而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的转化，干扰蛋白质的合成，以致植物死亡。草甘膦的除草性能优异并且价格低廉，因此广泛应用于农田各种杂草的防除，也常用于非农田杂草的治理[1]。随着抗草甘膦作物的培育成功，草甘膦的用量逐年递增，目前成为世界上用量最大、应用最广的除草剂之一，由于草甘膦大规模和大量的使用，其在土壤环境中的影响也受到世界各国的关注[2-3]。

1 草甘膦的环境危害

草甘膦在土壤中极易被吸附，代谢速度相对缓慢，在高剂量多年连续施用的情况下，其残余水平可能会逐年升高[4]。草甘膦盐类对植物的毒性程度不同，异丙胺盐和三甲基硫盐的毒性最高，胺盐次之，钠盐较小。草甘膦曾长期被认为是一种低毒、安全的除草剂，然而草甘膦在全球的大规模使用，使其在水体和土壤中累积量增加，已经对地表水、地下水和土壤的化学过程以及整个生态系统造成影响，并且给人类生存环境带来安全风险，威胁人类健康[5]。研究发现，土壤中残留的草甘膦会影响微生物的数量和土壤酶的活性，对放线菌数量和脲酶的活性有抑制作用，进而破坏土壤微生态[6-7]。土壤中残留的草甘膦会随地表径流进入地表水、地下水，水环境质量遭到破坏，造成水生生态的失衡[8]。

通常来说草甘膦对非靶标生物毒性较低，然而，随着草甘膦毒理学及生态效应研究的深入，草甘膦具有生殖毒性、诱突变性等环境激素效应的文献时有报道，草甘膦对人体健康和生态环境都存在极大的潜在危害[9-11]。近年来研究[12-13]表明草甘膦对水生生物、两栖类动物、藻类生物、土壤生物以及人和哺乳动物具有一定的毒性，对人和哺乳动物的毒性主要表现为细胞毒性、遗传毒性、生殖发育毒性、致癌性以及内分泌干扰作用等，但是关于草甘膦的毒性问题国际上仍然存在争议，特别是草甘膦致癌性的问题，甚至不同研究机构给出完全相反的结论[14-17]。

2 草甘膦质量标准

针对其对生物和生态环境潜在危害性，我国《生活饮用水卫生标准》（GB 5749-2006）[18]规定草甘膦在饮用水中的最大残留量限值为0.7mg/L，与美国环保署对地表水中的限量相同。目前，美国、欧盟和日本都制定了土壤中草甘膦残留标准，残留限值为0.1～0.5mg/kg，而我国现在尚无土壤中草甘膦残留量的明确规定。在《土壤环境质量标准》（修订）（GB 15618-2008）征求意见稿中，将草甘膦限值0.5mg/kg列入到有机污染物环境质量的第二级标准值，但修订的土壤环境质量标准一直没有公开发布。我国《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763-2014）[19]规定食品中草甘膦最大残留限量为0.05～5mg/kg，由于食品中草甘膦的残留与土壤中的残留密切相关，我们要关注土壤中草甘膦残留，进而保证农产品安全。虽然现已公开发布的《土壤环境质量 农用地土壤污染风险管控标准（试行）》（GB 15618-2018）[20]中无草甘膦这项控制指标，见表1。

表1 草甘膦相关质量标准

3 国内外相关分析方法

目前，草甘膦的测定方法主要有柱前或柱后衍生-液相色谱法、离子色谱法、柱前衍生-气相色谱、气相色谱-质谱法、超高效液相色谱-串联质谱法、毛细管电泳法、分光光度法等。

美国EPA只有推荐方法MRID 443265-06和MRID 443265-07测定土壤中草甘膦，而无发布的土壤中草甘膦及沉积物中的标准检测方法。在国标GB/T 5750.9-2006[21]和GB 5085.6-2007[22]分别规定了生活饮用水和危险废物中草甘膦的检测方法。2019年10月29日，生态环境部公开发布《土壤和沉积物 草甘膦的测定 高效液相色谱法》（HJ 1055-2019）[23]为国家环境保护标准的公告，该标准使用液相色谱-柱前衍生的方法，测定土壤和沉积物中的草甘膦。现将国内外相关测定草甘膦的标准分析方法总结见表2。表2中所列的方法涉及的介质有水、土壤和食品，基本上都采用液相/气相色谱法或者液质/气质联用，样品经过提取、净化，然后进行衍生化处理，色谱柱分离后采用FLD、ECD或FPD检测分析，灵敏度高；而DB37/T 4152-2020采用离子色谱法，不需要衍生化，色谱分离后电导检测器检测，与液相、气相色谱法比较，离子色谱操作简单，无污染，但灵敏度相对较低。

表2 国内外草甘膦标准分析方法

3.1 高效液相色谱法（HPLC）

高效液相色谱法由于其分析速度快、灵敏度高、定量精确和高自动化等特点，是目前广泛应用的分离分析技术。由于草甘膦为强极性两性化合物，没有发色和荧光基团，在使用液相色谱-紫外（荧光）检测器测定草甘膦残留之前，必须对样品进行衍生化的处理，步骤繁琐。王超等[24]通过考察柱前衍生、流动相等相关因素的实验条件，结合影响草甘膦检测精确度的单因素实验，建立了采用柱前衍生-高效液相色谱法，检测桑园土壤中草甘膦残留量的方法。并对该方法的准确性和精密度进行了验证，结果表明：草甘膦浓度在5.0～35.0μg/mL范围内，线性关系良好，相关系数为0.9992，在0.1～1.0μg/g添加量范围内，桑园土壤中草甘膦的平均回收率为98.5%～103.0%，变异系数为3.54%～4.08%。高俊海等[25]建立了测定土壤中草甘膦和氨甲基膦酸的液相色谱荧光法，土壤经0.1mol/LNaOH溶液提取、中性样液HLB固相萃取净化、FMOC-Cl碱性条件常温2h衍生化处理、二氯甲烷净化的方法制备待测溶液，采用高效液相色谱荧光检测器测定，结果表明，在2.0～100μg/L范围内线性关系良好（R2＞0.999）。针对土壤样品加标，草甘膦回收率为82.2%～86.8%，RSD%为0.3%～2.5%，AMPA回收率为61.8%～69.1%，RSD%为0.8%～1.2%。

3.2 高效液相色谱-质谱法

液相色谱-质谱法是国内外比较认可的检测方法，由于其良好的重现性和准确性，广泛应用于有机物的分析，许多研究也采用此方法分析水、土壤等环境介质中草甘磷。周芹等[26]采用液相色谱串联质谱技术，以磷酸钠和柠檬酸三钠混合溶液提取，净化后采用正向亲水性液相色谱柱梯度洗脱，通过多反应监测（MRM）负离子模式扫描进行测定，结果表明：草甘膦、氨甲基膦酸的线性范围为0.02～0.2μg/mL，相关系数（R2）分别为0.9995、0.9998，检出限分别为0.5μg/kg和0.6μg/kg，并进行3个水平的加标实验，草甘膦的回收率在79.67%～96.17%之间，RSD值为3.95%～7.49%；氨甲基膦酸回收率在77.83%～99.47%之间，RSD值为1.96%～3.89%。此方法前处理简单，不需要柱前衍生，具有检出限低、灵敏度高的优点。

文唤成等[27]通过对提取条件、色谱条件和质谱条件的优化，建立了以水为提取剂，采用超高效液相色谱-质谱法测定土壤中草甘膦残留量的方法，该方法的检出限为0.10mg/kg，加标回收率在85.8%～94.6%之间，方法操作简单、快速，加标回收率满足分析要求，方法重复性、稳定性较好。

3.3 离子色谱法

离子色谱法是利用待测物在离子交换树脂柱与流动相间的反复交换，使样品中各离子分离，根据电导的变化采用电导检测器检测的方法。草甘膦易溶于水，采用离子色谱法电导检测不需要衍生化，简化了前处理过程，具有选择性好，灵敏、快速的优点。Ioannis K等[28]采用Dionex AS18色谱柱，KOH梯度洗脱测定泉水和橙子中草甘膦和氨甲基膦酸的含量，方法检出限分别为0.54μg/L、0.01mg/kg。刘玉欣等[29]采用IonPac AS11-HC阴离子交换柱，通过条件的优化，在淋洗液20mmol/L KOH溶液，流速1.00mL/min，进样量100μL的色谱条件下，直接测定饮用水中草甘膦残留量，采集的水样需经抗坏血酸除去余氯，样品进入离子色谱分析前采用微孔滤膜过滤。张培志等[30]在碳酸钠和碳酸氢钠的混合淋洗液下，采用电导检测，对土壤样品中的常见无机阴离子和草甘膦进行分离测定，取得理想的分离效果和较高的灵敏度。杨健等[31]利用离子色谱结合磁固相萃取技术，建立了一种简单快速测定土壤样品中草甘膦残留的方法，并对提取溶剂、离子色谱条件以及净化吸附剂进行了优化。样品经水提取后，先用乙腈沉淀杂质，再用Fe3O4磁性纳米材料净化处理，经IonPac AS11－HC离子色谱柱分离，以30mmol/L KOH为淋洗液，使用电导检测器进行检测。

3.4 气相色谱法

由于草甘膦极性大、沸点高、缺少发色基团和荧光基团，采用气相色谱分析时，需要对样品进行衍生化，生成可以检测到的衍生物，前处理步骤繁琐。胡继业等[32]采用气相色谱法测定土壤和苹果中草甘膦的残留，土壤中草甘膦的最小检出量为9×10-12g，最低检出浓度为0.02mg/kg。王天玉等[33]采用固相萃取-气相色谱法测定三种中药材中草甘膦的残留，样品提取后经C18柱净化，在100℃条件下，与三氟乙醇（TFE）和三氟乙酸酐（TFAA）进行衍生化反应，使用氮磷检测器（NPD）检测，外标法定量。结果表明，草甘膦在0.05～10mg/L之间线性良好，相关系数0.9992，方法的检出限均为0.05mg/kg。草甘膦在薏苡仁、白茯苓和山药3种中药材中的加标回收率分别为97.6%～103.8%，88.8%～98.4%和92.1%～100.0%；相对标准偏差（RSD）分别为：4.2%～5.6%，3.0%～4.7%和3.4%～6.5%，以上方法学指标均符合农药残留分析的要求。

3.5 气相色谱-质谱联用法

气相色谱-质谱联用法具有高分离能力、高灵敏度的特点，在分离和检测方面具有优越性。美国EPA推荐方法MRID 443265-06采用气相色谱-质谱联用分析土壤中的草甘膦，该方法采用氨水和磷酸钾混合液（pH13左右）振荡提取，0.45μm膜过滤后，用七氟-1-丁醇和三氟乙酸酐衍生化，检测限0.05mg/kg。农业标准NY/T 1096-2006[34]规定了食品中草甘膦及其代谢物残留量的测定方法。试样以水提取，粗提液经二氯甲烷液液分配和离子交换柱（CAX）净化，用与三氟乙酸酐和七氟丁醇的混合液衍生化反应后，衍生物用气相-质谱联用仪定性，采用离子选择模式外标法定量。该标准的检出限为0.02mg/kg。该标准适用于蔬菜、水果和粮食类等产品中草甘膦及其代谢物残留量的测定。

3.6 分光光度法

在国标GB/T12686-2017[35]和GB/T 20684-2017[36]中，均介绍了采用紫外分光光度法测定草甘膦原药和水剂，该方法对实验室仪器设备要求不高，检测灵敏度不高，还存在受Fe2+、Fe3+和其他相近光吸收物质的干扰，限制了光度法在分析草甘膦上的广泛应用。董文庚等[37]利用草甘膦与微量过量的溴反应，剩余的溴能使罗丹明B褪色的原理测定废水中草甘膦的含量。在醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，草甘膦在0～0.5mg/L和0.4～0.9mg/L范围内，与吸光度呈现良好的线性关系，干扰实验表明，Fe3+、Fe2+和三乙胺对测定存在干扰，经过交换树脂和吸附树脂的净化，可消除干扰，方法用于测定草甘膦生产废水中的草甘膦时，回收率为94%～101%。

4 结束语

目前，色谱法是草甘膦检测应用最广泛的检测方法，由于草甘膦为强极性两性化合物、易溶于水、难溶于大多数有机溶剂、挥发性差、没有发色和荧光基团，在使用气相色谱法和高效液相色谱法测定前，必须进行衍生化处理，衍生化包括柱前和柱后衍生两种，衍生过程比较复杂，衍生副产物可能干扰测定，不适合大量样品检测，准确度的干扰因素也较多。相比于气相色谱分析，液相色谱法其前处理程序相对简化、衍生化操作可控性较好，并且草甘膦易溶于水，高效液相色谱法在前期处理和后期分离更具有优势。气质联机和液质联机检测的精密度和准确度较好，但对仪器和人员要求较高，检测成本高，不利于推广使用。光度法存在灵敏度不高、其他物质干扰的缺陷，而离子色谱法不需要衍生化，可以大体积进样分析，操作简便，对人体健康和环境没有危害，但灵敏度稍低于液相色谱法和气相色谱法。

本文对草甘膦残留的检测方法和研究进展进行综述，为检测方法的深入研究提供参考。草甘膦检测方法的研究，将有助于了解草甘膦在土壤中的残留状况，为草甘膦施用策略管理及环境生态监控提供有效的测试手段，从而进一步推进土壤中草甘膦残留标准限值的制定。