宛氏拟青霉提取物对淹水胁迫下玉米叶片叶绿素荧光动力学参数的影响

邢玉美，万云婷，刘延龙，王鹏飞，范 震，赵有欣，田晓飞

（聊城大学 地理与环境学院，山东 聊城252059）

0 引 言

【研究意义】玉米是我国重要的粮食作物，但其生长过程中容易因连续的季节性强降雨使根系处于水分饱和状态，产生淹水胁迫[1]。在玉米各个生育期遭受不同程度的淹水胁迫，均会影响玉米产量的形成[2]。采取适当的农业管理策略来减轻淹水胁迫对玉米生长造成的不利影响，对保障我国粮食安全生产和农业可持续发展十分重要。【研究进展】光诱导动力学（OJIP）曲线能够反映叶绿体膜上的蛋白复合体PSII的光反应过程变化[3]，通过分析OJIP 曲线中O、J、I、P 等相点的荧光特征，可以评估其电子传递过程中的量子效率等信息，分析植物对非生物胁迫响应机制[4]。淹水胁迫会导致植物根系周围的含氧量降低，根系呼吸受阻，叶片类囊体膜结构以及PSⅡ反应中心受到破坏，最终导致叶片PSⅡ系统的综合性能指数和光合速率下降[5]，阻碍作物正常生长。因此，利用OJIP曲线可以较好地探明玉米叶片光合系统对淹水胁迫的响应机制。

生物刺激素能够有效提高植物对非生物胁迫适应能力[6]，痕量浓度的生物刺激素就能够提高作物根系SOD、CAT 和POD 活性，缓解淹水、低温等逆境对叶片类囊体膜和光合系统的破坏，增强作物对环境的耐受性[7]。【切入点】宛氏拟青霉提取物是一类分离自野生沙棘根系的新型生物刺激素，痕量浓度下就可以有效提高作物对低温、盐胁迫等逆境的耐受能力[6,8]，但是利用快速叶绿素荧光诱导动力学技术，探究宛氏拟青霉提取物对（PVE）玉米幼苗应对淹水胁迫后的机制鲜有报道。【拟解决的关键问题】因此，本研究通过模拟淹水胁迫环境，研究叶面喷施PVE对解除淹水胁迫后玉米幼苗生长的恢复效果和叶片快速叶绿素荧光诱导动力学特性的影响，以期探明PVE 缓解玉米幼苗适应淹水胁迫的机理，为其在农业生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试新型生物刺激素来源于野生沙棘根系分离得到的宛氏拟青霉SJ1菌株（保藏号CGMCCNO.10114），将菌种经培养、发酵、浸提、抽滤等步骤后制备而成[9]。宛氏拟青霉菌株的提取物（Paecilomyces variotii，PVE）主要成分为小分子的低聚糖、糖蛋白、多肽、嘧啶核苷和氨基酸等物质，由山东蓬勃生物科技有限公司提供。供试玉米材料为抗性好，耐干旱，耐高温的郑单958。供试土壤取自聊城大学环境土壤学教学科研试验基地，土壤类型为石灰性潮土，其基本理化性质如：有机质量12.5 g/kg，全氮量0.7 g/kg，硝态氮量24.5 mg/kg，铵态氮量6.5 mg/kg，有效磷量17.2 mg/kg，速效钾量143.5 mg/kg，田间持水率为200 g/kg。

1.2 试验设计

试验于2020年10—12月在聊城大学环境土壤学实验室进行，试验过程中温度控制在（20±5）℃，光照条件为自然环境。选取籽粒饱满、大小均匀的玉米种子播种于塑料花盆（上部直径15 cm，下部直径10 cm，高15 cm）中，每盆播种1 粒。待长至三叶一心时选择长势一致的90 盆玉米苗进行淹水处理。将盆栽玉米苗放在人工设置的水槽内模拟涝害，水槽内水面高于盆内土面4 cm 左右，每2 天换水1 次。分别在持续淹水0、2、4、6 和8 d 后随机选择12 盆解除淹水胁迫（分别用W0、W2、W4、W6 和W8 表示），并平均分成叶面喷施清水的对照组和喷施0.05 μg/L PVE 的处理组，喷施时以玉米叶片正反两面全部润湿且无成滴液体滴下为宜。为使液滴更好地附着于叶片，清水和PVE 溶液中均加入0.05%的Tween-20黏附剂。解除淹水胁迫后，采用称质量法保持各处理土壤含水率为田间持水率的75%左右。在解除淹水胁迫后12 h 和60 h 选择倒二叶测定OJIP 曲线和净光合速率（Pn）等指标。

1.3 测定项目和方法

采用直尺测定株高，叶片净光合速率（Pn）和叶绿素快相荧光动力学曲线（OJIP 曲线）及其参数采用LI-6800新一代光合-荧光全自动测量系统（LI-COR，美国）进行测定，测定时每个处理选取3 株长势相同的玉米幼苗倒二叶进行测定。叶片充分暗适应12 h后测定，OJIP 曲线由1 500 μmol/(m2·s)红光诱导，测定时间为1 s。根据JIP-test 分析OJIP 荧光诱导曲线[10-11]，计算叶片单位横截面积能量流参数和反应中心密度等参数，各参数及其意义列于表1 中。

表1 JIP-test 分析OJIP 曲线参数及计算公式Table 1 Parameters used by JIP-test for the analysis of the fluorescence transient OJIP

利用Excel 2010 与SAS 8.5 软件进行绘图和数据处理，采用Duncan 法进行差异显著性检验，分析不同处理间的显著性（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 对玉米幼苗生长的影响

与正常水分处理相比，淹水胁迫降低了玉米幼苗株高（图1）。随淹水时间的延长，株高总体呈逐渐下降的趋势，说明淹水胁迫抑制了玉米幼苗的正常生长。W0+PVE 处理株高最高，较其余处理显著增加5.9%～16.9%。持续淹水超过4 d 后，相同淹水时间的喷施PVE 处理与喷施清水处理株高差异不显著，说明叶面喷施PVE 有助于短期淹水胁迫后玉米幼苗恢复生长，但长期淹水胁迫这种缓解效果有限。

图1 淹水胁迫下叶面喷施PVE 对玉米株高的影响Fig.1 Effect of PVE on the growth of maize under waterlogging

在解除淹水后12 h 和60 h 后，与正常水分管理处理（W0 和W0+PVE）相比，长期淹水胁迫（≥4 d）显著降低了叶片Pn值（图2）。与W0 处理相比，W2处理Pn值无明显变化，但W2+PVE 较W0+PVE 处理Pn值显著增加了21.1%。持续淹水时间≤4 d 时，各叶面喷施PVE 处理Pn值均显著高于叶面喷施清水处理；持续淹水≥6 d 时，叶面喷施PVE 和清水处理Pn值基本一致，同样说明叶面喷施PVE 能够有效缓解短期淹水胁迫对玉米幼苗生长的抑制作用，但对于遭受长期淹水胁迫的玉米幼苗缓解效果有限。

图2 淹水胁迫下叶面喷施PVE 玉米叶片净光合速率Fig.2 Effect of PVE on the net photosynthetic rate of maize under waterlogging

2.2 对玉米幼苗叶片OJIP 曲线的影响

淹水胁迫会导致玉米幼苗叶片OJIP 曲线发生明显的变化（图3）。与正常水分管理（W0 和W0+PVE）相比，淹水胁迫增加了在O 相处的初始荧光强度（Fo），但会导致叶片I 相（30 ms）和P 相（最大荧光）荧光值下降。淹水4 d 时，喷施清水和PVE 处理叶片OJIP 曲线总体趋势一致，但喷施清水处理在J 相荧光值高于PVE 处理，但对P 相荧光值（最大荧光）无明显差异，说明叶面喷施PVE 缓解了淹水胁迫下叶片PSⅡ受体侧QA到QB间的电子传递受阻情况。

图3 叶面喷施PVE玉米叶片OJIP曲线Fig.3 Effect of PVE on the OJIP curve of maize under waterlogging stress

将OJIP 曲线标准化后，正常水分管理下叶面喷施PVE 对ΔK和ΔI无明显影响，但降低了ΔJ值（图4），说明喷施PVE 有助于促进QA向QB的电子传递，减少了QA-积累。与W0 处理相比，淹水2 d 后的W2处理在30 ms 位点处的叶绿素荧光产量明显增加，表明淹水会对叶片PSⅡ的供体侧造成伤害，降低了向下游提供电子的能力。叶面喷施PVE 明显缓解了淹水胁迫下ΔK和ΔJ的增高，降低了淹水胁迫对叶片荧光系统造成的损害。

图4 淹水胁迫下叶面喷施PVE 叶片ΔVtFig.4 Effect of PVE on the ΔVt curve of maize under waterlogging stress

与正常水分处理相比，淹水胁迫提高了玉米幼苗叶片QA-被还原的程度（VJ）（表2），降低了电子传到电子传递链中下游的电子受体的概率（Ψo）和用于电子传递的量子比率（φEo），最终导致受体侧末端电子受体的量子产额（δRo）减少。叶面喷施PVE 缓解了淹水胁迫下VJ的升高和Ψo的降低，但在正常水分处理下叶面喷施清水与PVE处理间各参数差异不显著。

表2 淹水胁迫下玉米叶片VJ 和量子产额Table 2 Changes of waterlogging stress on the VJ and the yields or flux ratios in leaves of maize

与正常水分管理（W0 和W0+PVE）处理相比，

淹水胁迫减少了玉米幼苗叶片单位横截面积内反应中心的数量（RC/CSm），单位面积捕获的光能（TRo/CSm）和单位面积电子传递的量子产额（ETo/CSm），但增加了单位面积的热耗散（DIo/CSm）（表3）。随着淹水时间的延长，RC/CSm，TRo/CSm和ETo/CSm的下降幅度逐渐增大，并且DIo/CSm的上升幅度呈增大趋势。说明淹水胁迫会导致叶片用于电子传递的能量份额减少，热耗散增加，导致叶片光合性能指数（PIabs）降低。叶面喷施PVE 处理有效缓解了短期淹水胁迫后（≤4 d）叶片TRo/CSm和ETo/CSm的增加，说明在解除短期淹水胁迫后叶面喷施PVE 能够缓解叶片用于电子传递的能量配额减少，使受阻的电子传递恢复，从而提高单位面积上的光能利用率。

表3 淹水胁迫玉米叶片单位横截面积能量流参数和反应中心密度Table 3 Changes of waterlogging stress on the phenomenological energy fluxes per CS in leaves of maize

3 讨论

光合作用能够为植物生长发育提供物质和能量，但淹水胁迫逆境会使植物体内活性氧自由基大量积累[12]，类囊体膜上的电子传递活性和传递效率下降，光合机构吸收的光能无法被充分利用，导致叶片叶绿素合成和光合速率受到抑制[13]，阻碍有机物的正常运转，最终导致植物生长发育缓慢。长期淹水环境下叶片叶绿体结构被破坏，叶绿素量降低[14]，这与试验过程中观察到的淹水会导致玉米幼苗叶片逐渐发黄，甚至出现叶片脱落的现象相一致。同时，本研究结果还表明，淹水胁迫显著抑制了玉米生长（图1），降低了叶片的净光合效率（图2），解除短期淹水胁迫后玉米幼苗能够恢复正常生长，但长期连续淹水（＞4 d）会导致玉米幼苗倒伏，根系腐烂，即使解除淹水胁迫幼苗难以恢复正常生长。

水杨酸、芸苔素内酯、褪黑素和PVE 等生物刺激素与植物激素具有相似生理和生物学效应的一类物质，适宜的量可增强作物对非生物胁迫的适应能力[4,8-9]。Clouse 等[15]研究表明芸苔素内酯参与植物生长发育、管道分化及细胞增殖和凋亡等生理活动，能够促进细胞伸长、分裂，增强叶片的光合作用。而PVE作为高效且具有高活性的生物刺激素，芸苔素内酯、腐植酸钠等常规生物刺激素浓度的1/30 000 左右[8]。本研究结果表明，在解除短期淹水胁迫后叶面喷施PVE 提高了叶片净光合速率，减轻了淹水胁迫对玉米叶片光合机构和光合性能的破坏，有效缓解了淹水胁迫对玉米生长的抑制作用。

植物快速叶绿素荧光诱导（OJIP）曲线的相关参数可以反映PSⅡ供体侧、受体侧和PSⅡ反应中心原初光化学反应对外界环境变化的响应[16]。本研究结果表明，淹水胁迫增加了J 相荧光值（图3），说明淹水胁迫会使QA-大量积累，阻碍了PSⅡ受体侧QA向QB的电子传递，导致OJIP 曲线中因PS 中供体侧放氧复合体受到伤害而出现K 点[17]。将OJIP 曲线标准化后可以更直观地反映出玉米叶片光合机构及电子传递对淹水胁迫的响应（图4）。与正常水分处理相比，淹水胁迫（W4 和W4+PVE）处理ΔK和ΔJ值均>0，并且W4 处理ΔK和ΔJ值均高于W4+PVE 处理，说明淹水胁迫在破坏玉米叶片供体侧放氧复合体的同时还抑制了受体侧的电子传递[18]，而叶面喷施PVE可有效缓解淹水胁迫下玉米叶片ΔK和ΔJ的增加，能够对PSⅡ供体侧和受体侧起到保护作用。王晓琪等[19]则认为，PVE 可以通过提高植物体内过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性，降低Na+/K+和丙二醛量，从而提高水稻对非生物胁迫（抗盐、抗低温）的抗性。

正常条件下，PSⅡ反应中心将捕获的光能转化为激发能，大部分激发能用于推动碳同化，多余的激发能以热耗散的形式损失掉[18]。当植物遭受淹水胁迫时，由于PSⅡ电子供体侧、受体侧以及电子传递链的功能受损，导致PSⅡ反应中心能够吸收的光能不能及时传递给电子传递链[19]。本研究表明，短期淹水（≤2 d）对玉米幼苗叶片PSⅡ并未产生明显的胁迫反应，但长时间淹水会降低用于电子传递的量子产额（φEo）和捕获的激子将电子传递到电子传递链中超过QA-的其他电子受体的概率（Ψo）（表2）。此外，淹水胁迫还会减少玉米幼苗叶片单位面积内反应中心的数量（RC/CSm），造成PSⅡ反应中心部分降解或可逆失活，破坏天线色素结构[20-21]，降低单位面积吸收的光能（ABS/CSm）（表3），从而减少了反应中心激发能（TRo/CSm)和还原能（ETo/CSm）。与叶面喷施清水处理相比，叶面喷施PVE 处理缓解了短期淹水胁迫下捕获的激子将电子传递到电子传递链中超过QA-的其他电子受体的概率（ψo），改善了叶片PSⅡ受体侧的电子传递。同时，叶面喷施PVE 提高了玉米叶片单位叶面积的热耗散（DIo/CSm）（表3），降低了激发能的产生，减少过剩激发能机理对PSⅡ反应中心的伤害。因此，解除短期淹水胁迫后叶面喷施PVE 一方面通过恢复受阻的电子传递，提高单位面积上的光能利用率[22]，另一方面通过促进热耗散途径减少过剩激发能的积累，防止光合电子传递链的过度还原[23]，从而促进玉米幼苗快速恢复生长。但是在长期淹水胁迫（＞4 d）下，叶面喷施PVE 并不能完全消除淹水胁迫对叶片光合特性和OJIP 曲线的影响，有关PVE 对淹水后玉米产量和叶片代谢机理的整体调控效应还有待更深入的研究。

4 结论

1）长期淹水胁迫（＞4 d）显著降低了玉米叶片的光合性能，抑制了玉米幼苗正常生长，甚至导致玉米幼苗的死亡。淹水胁迫增加了初始荧光强度，降低了最大荧光值，在对玉米叶片PSⅡ反应中心供体侧放氧复合体造成损害的同时还阻碍受体侧造光合电子传递，导致单位叶面积吸收的光能、捕获的光能和电子传递的能量降低，从而抑制了玉米幼苗叶片光合机构的正常功能。

2）解除短期淹水胁迫后，叶面喷施PVE 能够提高叶片净光合速率，缓解了单位叶面积有活性反应中心数目的减少，使叶片PSⅡ受体侧受阻的电子传递恢复，并维持相对较高的热耗散能力，有助于玉米幼苗快速恢复生长，但叶面喷施PVE 并不能完全消除长期淹水胁迫对玉米生长造成的影响。