复合菌酶制剂对玉米秸秆黄贮发酵品质的影响

徐晓东，吴立坡，姜 宁，曹 阳，潘春媛，李凌岩，陈 勇，张爱忠

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江省寒区饲料资源高效利用与营养调控重点实验室，黑龙江大庆 163319）

我国是农业大国，在粮食高产的同时也产生了大量的农作物秸秆，然而农作物秸秆具有低能低蛋白、高纤维等特点，直接用作饲料时适口性差、利用率低、瘤胃降解率低，限制了秸秆资源在反刍动物粗饲料中的应用，所以我国农作物秸秆饲料年利用率不足30%[1]。若能合理地将秸秆作为饲料使用则可以降低饲料成本，提高养殖的效益。黄孢原毛平革菌是白腐真菌的一种，其分泌的胞外酶可降解秸秆中的木质素，使原本被木质素包裹的纤维素、半纤维素释放出来[2]，而纤维素酶、木聚糖酶可直接或间接通过物理或化学的作用使秸秆纤维结构得到膨胀和破坏[3]，经发酵后的秸秆，其粗纤维含量会大幅度下降[4]。魏志文等[5]用白腐真菌混合发酵玉米秸秆后其粗蛋白质平均含量达到21.87%。滤纸纤维的聚合度和结晶度能够较为真实地反映天然纤维素的情况。在实验室经常以纤维滤纸作为底物来测定微生物对纤维素的降解能力，其优点在于可直接用肉眼观察滤纸片崩解程度，如果裂解程度比较明显，大致可以认为这种微生物具有较好的降解功能。李林超等[6]通过滤纸崩解试验在多个菌种中筛选出了降解效果最佳的2 株菌种。本试验拟通过滤纸条崩解试验观察真菌、酶制剂分解纤维素的效果，进一步筛选发酵玉米秸秆条件，观察不同处理方法对玉米秸秆发酵品质的影响，为玉米秸秆饲料化的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 培养基 滤纸崩解培养基：KH2PO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.04 g，酵母粉0.01 g，H2O 100 mL。121℃灭菌20 min。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯浸粉3 g，葡萄糖20 g，琼脂14 g。

黄孢原毛平革菌液体培养基：马铃薯提取液1 L，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，维生素B1微量。121℃灭菌15 min。

1.1.2 菌种和酶 黄孢原毛平革菌（CICC 40299，中国工业微生物菌种保藏管理中心）活菌数1×108个/mL；纤维素酶酶活≥10 000 U/g，木聚糖酶酶活≥30 000 U/g，均为宁夏夏盛实业集团有限公司产品。

1.1.3 玉米秸秆 玉米秸秆收购于大庆市周边的农户，在自然风干后用粉碎机将其切短到2～4 cm。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种培养 菌种活化：将黄孢原毛平革菌冻干菌粉接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，在28℃条件下培养5 d，并转接活化2 次，放于4℃保存备用。

液体菌种培养：将黄孢原毛平革菌接种到液体培养基中，28℃、150 r/min 振荡培养7 d，然后采用血球计数板计数，将菌种的孢子浓度大致控制在1×108个/mL。

1.2.2 滤纸条崩解试验 将灭菌好的培养基放入无菌操作台备用，并按表1 分别添加浓度为0.2 g/L 的菌酶、纤维素酶和木聚糖酶，添加量为5 mL，黄孢原毛平革菌的接种量为20%。每个培养基中放入1/4φ12.5 cm 的扇形滤纸，摇匀使滤纸片平铺在锥形瓶底部，封口，于30℃、100 r/min 条件下摇瓶培养，隔天观察，并记录。

表1 滤纸崩解试验设计

1.2.3 玉米秸秆发酵试验 试验以纤维素酶和木聚糖酶的添加量、黄孢原毛平革菌接种量、发酵天数为单因素，考察其对玉米秸秆综合评分和中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）和酸性洗涤木质素（ADL）含量的影响，每组试验设3 个重复。将玉米秸秆装入25 cm×35 cm 聚乙烯袋内，每袋500 g，加入菌酶复合制剂后于30℃下进行密封发酵，并设置空白对照组，并将水分控制在60%～70%。

纤维素酶组分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/kg纤维素酶，0.3 g/kg 木聚糖酶，20%的菌接种量，发酵21 d。木聚糖酶组分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/kg木聚糖酶，0.3 g/kg 纤维素酶，20%的菌接种量，发酵21 d。菌接种量组分别接入10%、15%、20%、25%、30% 菌液，0.3 g/kg 纤维素酶，0.3 g/kg 木聚糖酶，发酵21 d。发酵天数组加入0.3 g/kg 纤维素酶，0.3 g/kg木聚糖酶，20% 的菌接种量，分别发酵7、14、21、28、35 d。

1.2.4 菌酶复合制剂发酵最佳条件 在单因素试验的基础上，选取纤维素酶添加量、木聚糖酶添加量、菌接种量和发酵天数4 个因素，以发酵品质的综合评分和NDF、ADF、ADL 含量为评定标准，来确定复合菌酶制剂发酵的最佳条件。

1.2.5 pH 及纤维含量的测定 采用pH 计（FE28 型，由梅特勒-托利多仪器有限公司生产）测定。NDF、ADF 和ADL 参考范氏洗涤纤维分析法[7]测定。

1.2.6 玉米秸秆发酵品质评分 参考青贮饲料质量评定标准（试行）[8]中的青贮玉米秸杆的评分标准。

1.3 统计分析 用Excel 2016 软件整理数据，最佳发酵条件试验采用SPSS 16.0 软件的 One-Way ANOVA、Duncan's 多重比较法进行分析，发酵验证采用SPSS 16.0 统计软件的独立样本t检验方法，试验数据用平均值±标准误表示，以P＜0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同处理方式对滤纸条崩解的影响 从图1-A 中可以看出，C2、C3 和C4 对滤纸均有一定的裂解作用，但裂解程度较差，到第5 天时还是有大片的滤纸块存在；从图1-B 中可以看到明显的裂解现象，C8 到第5 天时摇瓶内颜色略有变深，培养基出现浑浊，滤纸片完全裂解；其次是C7、C6 摇瓶内培养基略显变黄，仍存在小部分的碎片，C5 降解效果相对较差，摇瓶内还有较多的小块滤纸片存在。

图1 不同处理方式对滤纸条崩解的影响

2.2 不同发酵条件对玉米秸秆发酵品质的影响

2.2.1 不同纤维素酶添加量对玉米秸秆发酵品质的影响由表2 可见，纤维素酶添加量在0.2 g/kg 时综合评分相对较高，接近优质发酵，该组pH 相对较低，pH 越低发酵品质相对来说越好，其NDF 与ADF 高于0.1 g/kg 组（P＜0.05），与其他组差异不显著；各组间ADL 差异不显著。因此，纤维素酶添加量为0.2 g/kg 时较适宜。

表2 不同纤维素酶添加量下发酵玉米秸秆的综合评分

2.2.2 不同木聚糖酶添加量对玉米秸秆发酵品质的影响由表3 可以看出，木聚糖酶添加量在0.1 g/kg 时综合评分相对较高，该组的pH 相对较低，接近优质发酵，其NDF 和ADF 低于其他各组（P＜0.05）；ADL 高于其他组（P＜0.05）。因此，木聚糖酶添加量为0.1 g/kg 时较适宜。

表3 不同木聚糖酶添加量下发酵玉米秸秆的综合评分

2.2.3 不同菌接种量对玉米秸秆发酵品质的影响 由表4 可以看出，菌接种量在20%时综合评分相对较高，该组的pH 相对较低，接近优质发酵，其NDF、ADF 和ADL 与10% 和15% 组差异不显著，低于25%、30%各组（P＜0.05）；ADF 低于其他各组（P＜0.05）。因此，菌接种量为20%时较适宜。

表4 不同菌接种量下发酵玉米秸秆的综合评分

2.2.4 不同发酵天数对玉米秸秆发酵品质的影响 由表5 可以看出，在发酵21 d 时的综合评分相对较高，该组的pH 低于4.2，接近优质发酵，其NDF、ADF 和ADL低于发酵7 d 和14 d（P＜0.05），与发酵28 d 和35 d差异不显著。因此，发酵天数为21 d 时较适宜。

表5 不同发酵天数下发酵玉米秸秆的综合评分

2.3 复合菌酶制剂对玉米秸秆发酵品质的影响 由表6可知，试验组发酵的秸秆pH 低于对照组（P＜0.05），表明添加菌酶复合制剂可显著降低发酵秸秆的pH；从色泽、气味、质地感官评价来看，试验组发酵的秸秆优于对照组，其NDF、ADF 和ADL 低于对照组（P＜0.05）。综合来看，试验组发酵的秸秆其发酵品质明显优于对照组，并且属于优质发酵。

表6 最佳条件下的发酵秸秆与未发酵秸秆的综合评分

3 讨论

本研究结果显示，以C8（纤维素酶、木聚糖酶和黄孢原毛平革菌）组降解效果最佳，摇瓶内颜色变深且滤纸片完全崩解，且菌酶复合组明显优于单一菌、酶的降解效果，说明菌酶复合制剂在纤维素的降解过程中有很好的协同作用，能够加速对滤纸片的崩解，原因是滤纸经过白腐真菌降解后其孔隙会增加，进而增加了纤维素酶和木聚糖酶与滤纸的接触面积，使滤纸中的纤维素和半纤维素快速酶解，所以菌酶复合添加比单一添加菌、酶的降解效果好。王元明[9]筛选出2 株能够降解稻秆的菌株F1、F2，且两者混合培养对滤纸的崩解效果更好。

水分是影响秸秆品质的重要因素。当水分过高时，导致营养物质渗出，降低了营养价值，同时会使秸秆发霉变质；当水分过低时，会使营养物质流失，而且密封性差，不易形成无氧条件，容易造成需氧发霉。所以水分过高或过低都会导致青贮失败[10]，因此发酵饲料的适宜含水量一般调整为60%～70%[11]。从本试验结果看，发酵结束后水分在62%～65%，水分调整的较好。据报道，细菌的生长易受水分的影响[12]。适宜的水分可以浓缩可溶性碳水化合物等营养物质，有利于提高细菌发酵和青贮品质。

pH 决定了饲料最终发酵品质的好坏及其营养损失的情况。本试验中，通过黄孢原毛平革菌、纤维素酶和木聚糖酶处理后的玉米秸秆其pH 迅速降低，与对照组差异显著。pH 降低可能是因为黄孢原毛平革菌固体发酵分泌的锰过氧化物酶、漆酶、木质素过氧化物酶等胞外酶通过破坏玉米秸秆中木质素的复杂结构，释放出被其包裹的纤维素和半纤维素，再通过高效的酶制剂降解纤维素和半纤维素，使秸秆内的营养物质释放出来，然后乳酸菌利用这些营养物质产生大量乳酸，从而降低pH。白冰等[13]通过添加乳酸菌和纤维素酶对玉米秸秆进行发酵，在30℃其pH 显著下降。谢凤莲等[14]发现，添加复合益生菌和纤维素酶对艾草进行发酵后，其pH 有显著降低。万江春等[15]发现，添加乳酸菌和纤维素酶青贮发酵棉花秸秆青，可以显著降低棉花秸秆的pH，提高棉花秸秆的发酵品质。

发酵秸秆的综合评分能够反映秸秆发酵品质的好坏。本研究结果表明，添加菌酶复合制剂可显著改善黄贮玉米秸秆的品质，且发酵后的黄玉米秸秆具有酸味、疏松、不黏、淡黄色等特点。欧阳佳良等[16]研究结果表明，添加酶菌后可以显著提高发酵秸秆的感官评价。古辉辉等[17]通过添加乳酸菌和纤维素酶对皇竹草进行发酵后，其感官评价显著高于对照组。

4 结论

本研究结果表明，以纤维素酶、木聚糖酶和黄孢原毛平革菌共同处理滤纸片的降解效果最好，在培养5 d后培养基出现浑浊，滤纸片完全裂解；菌酶复合制剂发酵玉米秸秆发酵品质较对照组显著提升，使反刍动物可以更加有效低利用这些秸秆资源。本试验筛选出的最佳发酵条件为纤维素酶添加量0.2 g/kg、木聚糖酶添加量0.1 g/kg、黄孢原毛平革菌接种量20%、发酵天数21 d，在此发酵条件下玉米秸秆发酵品质显著高于对照组，且属于优质发酵，其NDF、ADF 和ADL 分别比对照组降低了23.4%、20.13%、7.68%。