17℃保存对猪精子亚组分蛋白酪氨酸磷酸化的影响及中药保护作用

2021-11-09胡启蒙谢海霞徐静溪李秋玲

中国畜牧杂志 2021年9期

胡启蒙，谢海霞，徐静溪，杨乐，李秋玲

（1.廊坊师范学院生命科学学院，河北省动物多样性重点实验室，河北廊坊 065000；2.苏州大学基础医学与生命科学学院，江苏苏州 215006；3.河北师范大学生命科学学院，河北石家庄 050024）

目前，主要猪肉生产国90%以上的精子采用17℃液态保存，这种保存技术具有成本低、适应远距离运输等优点[1]，但由于细菌滋生和氧化损伤等，保存时间只有3～7 d[2]。目前17℃液态保存对猪精子功能的影响尚不清楚。

新鲜射精的精子需要“获能”才具有受精能力，其中蛋白酪氨酸磷酸化是获能指示事件，传统精子质量检测方法不能确切反映精子的受精能力。本实验在保存稀释液中添加外源性抗氧化剂（芜青Brassica rapa L./ 红花Carthamus tinctorius L./丹参Salvia miltiorrhiza Bge.水提液）、抗菌剂（广藿香Pogostemon cablin（Blanco）Benth.水提液）及提高精子活力（菟丝子Cuscuta chinensis Lam./淫羊藿Epimedium brevicornum Maxim.水提液）[3]成分，旨在为解决精子保存中的氧化损伤及细菌滋生等问题[4]。精浆在精子保存中起到维持精子完整性、渗透压及提供营养等功能，但其去获能因子也会造成精子质量下降。

本文采用精子全蛋白及亚组分蛋白酪氨酸磷酸化差异来评估17℃保存效果；通过获能酪氨酸磷酸化指标分析精浆存在与否对保存精子质量的影响；利用荧光免疫定位和酪氨酸磷酸化位点差异，检测中药保护成分作用机制，为精子常温保存液培养优化奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试试剂蛋白酪氨酸磷酸化一抗购于Millipore 公司，相应二抗、内参抗体GAPDH、细胞膜及胞浆蛋白分离试剂盒、细胞核及胞浆蛋白分离试剂盒等均为上海碧云天生物技术有限公司产品。过氧化氢酶（CAT）、微量丙二醛（MAD）和总超氧化物歧化酶（T-SOD）测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品。氯化钠、碳酸氢钠和甲醇等试剂均为上海国药试剂公司产品。

1.2 精子采集供试种猪为成年、健康状态良好、繁殖性能优秀的杜洛克猪。新鲜猪精子采集后，放入37℃恒温箱中迅速带回实验室备用。

1.3 实验设计

1.3.1 未获能与获能条件下新鲜和17℃液体保存猪精子亚细胞蛋白酪氨酸磷酸化动态变化未获能培养液成分：2.7 mmol/L 氯化钾，1.5 mmol/L 磷酸二氢钾，8.1 mmol/L 磷酸二氢钠，137 mmol/L 氯化钠，5.55 mmol/L葡萄糖，2.0 mmol/L 丙酮酸钠，pH 为7.4。获能培养液在未获能培养液的基础上添加25 mmol/L 碳酸氢钠、2 mmol/L 氯化钙和0.4% BSA，pH 为7.4。将相同精子浓度的新鲜精子组和17℃保存精子组精液分别加入等量的获能培养液或未获能培养液培养，使用培养箱37℃、5% CO2培养2 h。

1.3.2 中草药对17℃液体保存猪精子的保护作用分析实验分为去精浆组和保留精浆组，并将其再分为对照组和中药添加组，通过前期实验（水提液pH、精子活力和存活率）筛选最佳使用浓度。中药添加组分别为芜青、菟丝子、淫羊藿、红花、丹参和广藿香。分别将1 g 芜青、1 g 菟丝子、1 g 淫羊藿、0.1 g 红花、1 g 丹参和1 g 广藿香在100 mL 超纯水中煮沸15 min，待冷却后，过滤上清液测量pH。芜青水提液pH 5.61，菟丝子水提液pH 6.73，淫羊藿水提液pH 5.81，红花水提液pH 5.80，丹参水提液pH 5.65，广藿香水提液pH 5.92。

将新鲜猪精液等量分成2 份，一份低速离心去除精浆，使用未获能培养液补足体积；另一份保留精浆。对照组使用Androstar plus 稀释粉和超纯水配置成10 mL精子稀释液，实验组使用1 mL 中药水提液和9 mL 超纯水配置10 mL 稀释液，各组加入等量的精液，混合均匀后，测量各组pH，随后放入17℃恒温箱中保存。各处理组原始pH 见表1，在保存过程中各组pH 调整至7.4。

表1 中药添加各组原始pH

1.4 精子质量分析精子质量分析包括活力、存活率以及顶体反应率，测定方法参照文献[5]。

1.5 氧化指标检测保存精子中总超氧化歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性和丙二醛（MAD）含量检测方法参考文献[6]。

1.6 免疫印迹

1.6.1 蛋白提取与定量全蛋白、Triton 溶解性与非溶解性蛋白通过配制蛋白裂解液提取，亚组分蛋白通过蛋白提取试剂盒提取。最后通过蛋白定量试剂盒统一样品浓度，试剂盒均由上海碧云天生物技术有限公司提供。

1.6.2 丙烯酰胺凝胶电泳与免疫印迹蛋白样品使用12% 丙烯酰胺凝胶电泳分离，取出带有蛋白样品的凝胶，使用转膜仪10 V，12 h 将凝胶上蛋白样品转移至预处理的PVDF 膜上。转膜完成后，PVDF 膜用TBST缓冲液清洗，孵育至1% BSA 的TBST 封闭液中1 h，清洗PVDF 膜3 次，每次10 min。加入一抗（1:10000）孵育4 h，清洗膜3 次，每次10 min。使用对应二抗（1:10000）并4℃孵育2 h。清洗膜后，使用ECL 覆盖PVDF 膜5 min，放入暗盒入暗室曝光。所得带有蛋白条带的胶片用伯乐凝胶成像系统拍照。

1.7 免疫荧光取待测精子样品200 μL 加入适量10%甲醇溶液，4℃过夜。离心去除上清液后，细胞沉淀使用低温PBS 缓冲溶液清洗3 次。取60 μL 精子样品均匀涂抹至载玻片上室温下至风干。3.7% 甲醇溶液覆盖载玻片上的精子样品固定20 min。洗脱液（PBS 0.1%Tween-20）清洗5 次，每次3 min。渗透液（PBS 0.5%TritonX-100）渗透样品5 min。清洗5 次，每次3 min。封闭液（1% BSA 洗脱液）4℃封闭2 h。清洗5 次，每次3 min。一抗（1:5000）避光孵育4℃过夜。清洗5次，每次3 min。对应二抗（1:1000）4℃避光孵育2 h。清洗5 次，每次3 min。使用荧光显微镜（OLYMPUS DP73）观察并拍照。

1.8 统计分析应用Image J 图像分析软件和Excel 2010 记录数据，采用SPSS Statistics 20 统计分析软件对数据进行单因素方差分析，采用Duncan's 多重比较检验对照组与其他组之间结果的差异，差异显著水平设定为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 精子质量实验所用新鲜猪精子组精子密度约为1.9×105/mL，精子活力约95%。17℃保存猪精子浓度约为9.8×104/mL，精子活力约为86%，保存的精子运动速度比新鲜精子慢，但保存精子随着时间增加（0～7 d）其活力和存活率均下降（表2）。

表2 获能培养后精子质量 %

经过体外获能培养后，获能精子处于超激活运动状态，17℃保存精子组的超激活运动比例较新鲜精子低。保留精浆保存组所包含的快动精子比例高于去精浆保存组。有精浆存在的保存组，其因细菌滋生而造成的精子聚集现象明显多于去除精浆的保存组，且此现象较去除精浆保存组早出现。

2.2 T-SOD、CAT 活性和MAD 含量由表3～5 可知，保存第3 天，除了芜青添加组，其他各保留精浆组T-SOD活力均高于去除精浆保存组。保存第4 天，去精浆保存组CAT 活力均高于保留精浆组。保存第5 天，除了对照组以外，MAD 含量去除精浆各组均低于保留精浆组。

表3 保存第3 天各组T-SOD 活性 U/mgprot

表4 保存第4 天各组T-CAT 活性 U/mgprot

表5 保存第5 天各组MAD 含量 nmol/mL

2.3 精子蛋白酪氨酸磷酸化精子培养后，全蛋白酪氨酸磷酸化（PTP）主要发生在30～32、35～37、40～45、46～55、56～70 ku，以及10 ku 存在低丰度蛋白。本实验提取的膜蛋白浓度较低，因此其内参抗体灰度值极低，未在此展示。通过蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度确保蛋白上样量保持一致。总蛋白的绝对含量低于亚组分蛋白的绝对含量，因此SDS-PAGE 上的蛋白浓度相同，但亚组分蛋白含量高于总蛋白。因此，相同分子量蛋白质在亚组分结果中的灰度值高于总蛋白质的灰度值。

由图1 可知，新鲜精子未获能（N-Cap）组中分子量约为40～45 ku 和46～50 ku 的PTP 水平高于17℃保存的N-Cap 组。新鲜N-Cap 组的高分子量蛋白约65 ku以及小分子量蛋白约32～35 ku 的PTP 水平弱于17℃保存的N-Cap 组。特别是分子量约为32 ku PTP 明显高于新鲜组，这些可能是由低温引起的。

图1 17℃保存对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化的影响

新鲜猪精子获能（Cap）组分子量为40～45、46～50 ku的PTP 程度强于17℃保存Cap 组。而17℃保存Cap 组的小分子蛋白PTP 水平在32～37 ku 高于新鲜Cap 组。17℃保存Cap 组40～45、46～50 ku 分子量膜蛋白PTP强度明显低于新鲜Cap 组。

Triton 不溶性蛋白获能组PTP 也有类似于全蛋白的变化趋势，特别是32 ku PTP 水平17℃获能组明显高于新鲜精子获能组。

猪精子PTP 核蛋白的分子量主要在20、32、35、40、50 ku，PTP 膜蛋白的分子量约为32、40、50 ku。

保留精浆保存组和去除精浆保存组经过6 d 保存，随后进行获能培养，两组蛋白酪氨酸磷酸化免疫结果主要的差异存在于20 ku 分子量蛋白。去精浆组20 ku 分子量蛋白发生酪氨酸磷酸化，但保留精浆组此分子量蛋白几乎未发生酪氨酸磷酸化（图2）。

图2 中药保护剂对精子酪氨酸磷酸化的影响

2.4 酪氨酸磷酸化蛋白的免疫荧光定位猪精子蛋白酪氨酸磷酸化荧光主要发生在鞭毛和头部前端、赤道段。获能各组PTP 荧光强度高于未获能（图3）。新鲜猪精子蛋白PTP 荧光强度高于17℃保存组。

中药成分稀释液对精子获能精子酪氨酸磷酸化影响荧光定位显示（图4），其抗氧化（红花和丹参）、抗菌（广藿香）以及提高精子活力（菟丝子和淫羊藿）的保护作用主要发生在鞭毛中段和主段，此部位的蛋白酪氨酸磷酸化出现差异。芜青、红花和丹参水提物在精子保存中免疫荧光定位酪氨酸磷酸化强度最强，鞭毛中段和主段PTP 水平均较高。去精浆组添加菟丝子水提液对获能精子鞭毛PTP 具有良好的效果，但在有浆组其效果较差。淫羊藿水提液在保存中对获能猪精子蛋白PTP 效果和对照组相同。广藿香水提液对猪获能精子中段酪氨酸磷酸化出现部分荧光缺失。精浆组中获能精子蛋白PTP鞭毛主段荧光强度差，有些出现部分缺失。

图4 荧光免疫定位猪精子酪氨酸磷酸化蛋白

3 讨论

3.1 17℃保存对猪获能精子亚组分蛋白酪氨酸磷酸化的影响

3.1.1 膜蛋白相比于新鲜猪获能精子，17℃保存猪获能精子分子量为40～45、46～55 ku 膜蛋白酪氨酸磷酸化程度减弱，可能是低温及活性氧（ROS）堆积导致精子膜完整性受损，从而使膜蛋白丢失；17℃保存也会导致微生物繁殖，导致精子膜损伤紊乱。相比于其他物种，猪精子更容易受到氧化应激损伤，因为猪精子膜具有高浓度不饱和脂肪酸，具有低固醇/磷脂比率[7]。精子细胞膜对维持渗透压平衡以及内外界环境交流提供可能；精子功能实现所需的酶以及离子通道附着在膜结构上，起到调节能量代谢以及运输离子等功能。冷冻和渗透性休克导致精子质膜流动性和通透性降低，导致精子早期获能样改变[8]。已有研究发现获能猪精子膜蛋白酪氨酸磷酸化主要分布在分子量27、34～37、40～47 ku 以及55 ku，这些蛋白与识别和融合卵子透明带有关[9]。精子获能会增加精子质膜流动性，从而激活Ca2+和离子流入细胞事件，促进cAMP 依赖性PKA 活力增加[10]。精子稀释液是在精子在体外赖以生存的环境，以保护精子的正常功能为目的[11]。因此，精子稀释液优化研发目标多集中于对精子膜的保护。

3.1.2 浆蛋白本实验中，无论是获能还是未获能组，17℃保存精子中30～35 ku 蛋白PTP 高于新鲜精子。结合Triton 非溶解蛋白以及核蛋白PTP 结果，推测30～35 ku 为胞浆蛋白。细胞质是糖酵解发生的部位，对精子运动产生直接影响。本研究结果表明，与获能新鲜精子组和17 ℃保存精子组相比，分子量为20～25、35 ku 和50～55 ku 的酪氨酸磷酸化水平有差异。其中，35 ku 的差异明显，17℃保存对35 ku 骨架蛋白有影响。17℃保存的非获能精子中分子量约为30～35 ku 的蛋白质酪氨酸磷酸化率类似于新鲜获能组，出现似“获能”现象，可能原因是运动相关蛋白肌动蛋白和微管蛋白在冷冻过程中表达上调[12]，精子顶体完整性受损，细胞骨架发生迁移，这种情况不利于精子受精。

3.1.3 核蛋白精子核蛋白在分子量为15～25、35、40、42～50 ku 发生酪氨酸磷酸化。保存精子和新鲜组核蛋白无明显差异，这表示保存过程对精子核完整性无明显影响，常温保存技术虽然存在不足，但其在保持精子遗传物质完整性方面效果良好。在全蛋白PTP 结果中未检测到15～25 ku，原因是核蛋白中15～25 ku 绝对含量高于全蛋白，如果提高全蛋白上样浓度，可检测到15～20 ku 蛋白PTP。

3.2 中药提取物对保存猪精子的保护作用 SOD 是生物体最重要的抗氧化物酶之一，在清除氧自由基方面起着重要作用。CAT 作为一种活性氧清除剂，可分解H2O2，防止精子膜脂质过氧化。MAD 是氧自由基产物，ROS 可以攻击生物膜物种的多不饱和脂肪酸，引起细胞损伤，也可以通过脂质过氧化物的分解产物引起细胞损伤。MAD 含量可以反映体内脂质过氧化的程度，间接反映细胞损伤的程度。

本实验结果显示，添加中药提取物保存1～3 d 过程中精子运动主要受到能量以及氧化损伤影响；保存6～7 d时，精子的存活率主要受细菌滋生影响；保存1～3 d 中，丹参组精子活力最高，推测丹参多糖可提供精子运动所需的能量代谢原料；4～5 d 时，红花添加组抗氧化能力较强；6～7 d 时，广藿香组具有较好的抑菌能力，添加了藿香水提液的保存精子中细菌聚集产生的数量少且出现时间较晚；菟丝子或淫羊藿添加组在提高精子活力方面无明显差异。

酪氨酸磷酸化蛋白对精子获能相关的顶体反应和超激活运动调节起到重要作用[13]。哺乳动物获能精子酪氨酸磷酸化蛋白主要定位于鞭毛，顶体前端以及赤道部。酪氨酸磷酸化激活精子超激活运动顺利穿越雌性生殖道穿透卵子透明质带，同时也激发顶体反应，释放顶体酶识别并与卵子融合[14]。精子的能量代谢主要包括鞭毛主段的糖酵解途径和中段线粒体氧化磷酸化途径[15]，这些功能的实现均需要酪氨酸磷酸化调控。

芜青为芸苔属，具有抗氧化及抗菌活性[3]。红花所含的红花素对超氧自由基和β-胡萝卜素/亚油酸偶联氧化系统有明显的抑制作用[4]。丹参以丹酚酸为代表的水溶性成分具有良好的抗氧化、抗凝血和细胞保护作用[4]。芜青、红花和丹参水提物在精子保存中表现出较强的抗氧化能力，对精子鞭毛酪氨酸磷酸化减少氧化损伤起到一定的保护作用。鞭毛主段糖酵解和中段线粒体氧化磷酸化是为精子提供能量的主要途径。外周致密纤维蛋白-2（ODF-2，93 ku），Ropporin 1（ROPN1，25 ku）以及电压依赖性阴离子通道（VDAC，28～36 ku）均定位于精子鞭毛处，在获能期间发生酪氨酸磷酸化参与调控精子超激活运动[16-18]。推测芜青、丹参以及红花水提液为减少氧化损伤，保证线粒体功能正常以及维持超激活运动所需要的能量起到作用。菟丝子具有抗氧化活性且可提高体外培养人精子活力[4]。淫羊藿中的淫羊藿B、C水溶性好含量高以及淫羊藿多糖等具有免疫刺激作用[4]，未对获能精子蛋白PTP 起到明显提升的效果，可能是通过影响精子其他途径来实现提高精子活力的目的。广藿香具有抗菌和抗疟疾的作用，在体外其水提取物也抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌等[4]，其水提液对猪获能精子中段酪氨酸磷酸化出现部分荧光缺失，可能广藿香的抑菌能力对猪精子鞭毛中段PTP 造成抑制，具体原因需进一步实验探究。可见，保存精子受到氧化和细菌生长的损伤，会对精子蛋白酪氨酸磷酸化造成影响，尤其是精子鞭毛的中段，从而影响线粒体功能，抑制精子的运动。

3.3 精浆对保存猪精子的影响保留精浆保存组所包含的快动精子比例比去精浆保存组高，说明精浆中的营养成分可提供精子保持较高的运动状态。虽然精浆在提供精子保护和能量方面起作用[19]，但不利于精子存活，因为运动状态活跃，能量消耗大，其代谢产物堆积，如活性氧对保存中的精子都是不利条件。同时有精浆存在的保存组，其因细菌滋生而造成的精子聚集现象明显多于去除精浆的保存组，且此现象较去除精浆保存组早出现。从氧化指标、免疫印迹以及免疫荧光结果来看，去精浆组对精子保存后获能酪氨酸磷酸化效果好，这种差异造成的原因可能是精浆种含有去获能因子[20]。去除精浆，加入各种中药保护剂，对获能精子酪氨酸磷酸化具有保护作用。