3个伞形科植物CPP基因家族的比较基因组学分析

巩克 王希胤

摘    要：CPP基因家族是一个转录因子家族，具有多种生物学功能。通过利用比较基因组学的方法，对芹菜、香菜和胡萝卜3个伞形科的物种进行分析，并将结果与莴苣、葡萄和拟南芥的CPP基因家族进行比较。结果显示，在3个伞形科物种中共鉴定了26个基因，其中芹菜、香菜和胡萝卜中分别有8个、12个和6个;香菜中的同源基因数量远大于芹菜和胡萝卜;全基因复制在CPP基因家族的扩张中发挥了重要的作用。同时，通过RNA-seq分析了不同组织中CPP基因的表达，将为伞形科中CPP和其他基因家族的比较和功能分析提供参考。

关键词：伞形科;基因家族;CPP-like

文章编号： 1005-2690（2021）16-0011-03       中国图书分类号： Q943.2       文献标志码： B

芹菜、香菜、胡萝卜是伞形科的3个代表性物种，生长在世界各地，以其香味和药用价值而闻名[1]。同时，这3种作物也具有很高的经济价值。

CPP转录因子在基因家族中是一个小型的转录因子家族。其成员典型特征是存在一个或两个类似的富含Cys的结构域，被称为CXC结构。从变形虫到植物，再到哺乳动物，CXC结构域表现出高度的保守性，CXC结构在不同的物种中表现出高度的一致性[2]。CPP-like基因在生殖组织的发育和控制植物细胞的分裂中发挥着重要作用。

目前，基于多个物种基因组数据的公布，CPP转录因子家族已经在拟南芥、水稻、茶树、陆地棉和大麦等多种植物中得到鉴定和分析[3-6]，但对于伞形科物种的CPP基因家族的全面分析尚未有报道。

对伞形科的3个代表性物种的CPP基因家族进行鉴定和分析，以期阐明CPP家族进化规律，并探索芹菜和香菜不同组织中的基因表达模式，研究结果为进一步挖掘伞形科CPP转录因子家族的功能奠定基础。

1   结果与分析

1.1   基因组序列的获取与CPP家族基因的鉴定

在葡萄、拟南芥、莴苣、芹菜、香菜和胡萝卜中共鉴定了46个CPP基因，并根据这些在染色体上的顺序重新进行了命名（见表1）。为探索CPP基因家族的进化历史和关系，利用上述6个物种的46个CPP氨基酸序列构建了系统发育树。根据系统进化树的拓扑结构，并参考拟南芥的分类标准，将CPP家族分为Ⅰ、Ⅱ两个类群。Ⅰ类包含19个基因，Ⅱ类包含27个基因。

1.2   CPP家族基因的结构分析和保守Motif分析

Motif分析显示，Ⅰ类和Ⅱ类家族拥有的motif存在较大的差异，Ⅰ类家族中普遍缺少motif3、motif5和motif10，Ⅱ类家族除AgCPP4外，普遍缺乏motif6、motif7和motif8。结构域分析显示，大部分的CPP基因家族都拥有两个TCR超家族结构域，而AgCPP1、AgCPP8、CsCPP4、CsCPP11和LsCPP3只拥有1个TCR超家族结构域，其中CsCPP4还拥有1个NT_Pol-beta-like超家族结构域以及1个TRF4超家族结构域。

1.3   CPP家族基因的同源性分析

通过对芹菜、香菜和胡萝卜的CPP家族基因同源性分析，芹菜与香菜之间发现了18对直系同源基因，其中有3个基因对不能被定位到任何染色体上。芹菜和胡萝卜之间发现12对直系同源基因。香菜和胡萝卜之间发现16对直系同源基因，其中有3个基因对不能被定位到任何染色体上。同时，在芹菜内部发现3对旁系同源基因。香菜内部发现10对旁系同源基因，其中有5对基因不能被定位到染色体上。胡萝卜内部发现3对旁系同源基因。

通过计算芹菜、香菜和胡萝卜直系同源基因对的Ks值和Ks/Ka的值，推断它们的分歧时间。结果显示，直系同源基因对的分化时间在芹菜和香菜之间为12.03～91.35百万年，在芹菜和胡萝卜之间为22.33～88.92百万年，在香菜和胡萝卜之间则为20.29～93.76百万年。

1.4   CPP家族基因的扩张与全基因组复制

檢测5种基因复制的类型在芹菜、香菜和胡萝卜中分布。结果显示，全基因复制可能在伞形科物种CPP基因家族的扩张中起到了重要作用。在芹菜、香菜和胡萝卜中，分别有75%、58%、100%的CPP基因是通过WGD产生的。除此之外，在芹菜中，有1个CPP基因属于单拷贝复制类型，1个CPP基因属于散布复制类型。在香菜中，有3个CPP基因属于单拷贝复制类型，2个CPP基因属于串联复制类型，见表2。

1.5   CPP家族基因的表达分析

通过分析CPP基因在芹菜和香菜不同组织中的表达模式，结果显示，在芹菜的根、叶柄和叶3个组织中，AgCPP2在根部和叶中的表达水平最高，AgCPP6在叶柄中的表达水平最高，AgCPP8在3个组织的表达水平最低，不同组织之间的差异并不明显，这表明CPP家族基因在不同组织间的表达可能没有太大差异。在香菜根、茎、叶和花4个组织中，CsCPP4在所有组织中都有着最高的表达。而CsCPP1、CsCPP2、CsCPP3、CsCPP11、CsCPP12和CsCPP13在4个组织中的表达都非常低。CsCPP5在根部的表达水平较高，这可能暗示该基因与根部的生长发育有密切的联系，香菜在4个组织中也没有表现出明显的差异（见图1）。

2   讨论

CPP转录因子参与植物生长和发育过程，例如拟南芥AtCPP家族成员对芽、根及花序的发育发挥着重要的作用[7]。同时，CPP也受到多种非生物胁迫的调控，在不同的胁迫处理下，CCP基因的转录表达水平较对照处理均表现出显著提高。

尽管在CPP基因家族在许多植物中被研究过，但在伞形科中还没有相关文献及研究。最近发布了芹菜、香菜和胡萝卜的全基因组序列，促进了研究进程。为了解CPP基因的进化，利用芹菜、芫荽、胡萝卜、拟南芥、莴苣和葡萄的CPP氨基酸序列构建了一个系统发育树。基因结构和保守图案分析显示，同组或亚组的基因表现出类似的特征。香菜中的旁系同源基因对的数量明显多于芹菜和胡萝卜。此外，基于共线性分析，发现了WGD对芹菜科的ARF基因家族扩展有明显影响。通过对3个芹菜科物种的ARF基因家族进行全面分析，为植物中ARF基因家族的比较和功能分析奠定了坚实的基础。

3   材料与方法

3.1   基因组序列的获取与CPP基因的鉴定

芹菜和香菜的全基因组序列从香菜数据库中的获取[8]，拟南芥、胡萝卜、莴苣和葡萄的基因组序列从JGI下载。使用CPP蛋白的保守结构域（PF03638）的隐马尔可夫模型来搜索，E值设定为1e-5。

3.2   系统发育树的构建

芹菜、香菜、胡萝卜、拟南芥、莴苣和葡萄CPP家族的氨基酸序列被用于系统发育分析。使用MAFFT[9]对所选物种的氨基酸序列进行比对，使用IQ-TREE[10]的最大似然法构建系统发育树，使用JTT+R3模型。

3.3   CPP基因的染色体位置、基因结构和保守基序分析

从基因组物理位置文件中检索每个CPP基因的染色体位置，并使用Perl脚本提取每个基因的染色体编号、起始位置和终止位置。使用TBtools绘制每个基因在染色体上的分布图。使用CDD网站分析CPP家族的保守结构域。利用MEME网站分析CPP家族的motif。根据基因组物理位置文件、CDD结构域预测结果和MEME预测结果，并对其进行可视化。

3.4   同源基因对的鉴定

使用OrthoMCL软件[11]鉴定直系同源基因和旁系同源基因，e值为1e-5。使用TBtools展示CPP基因在芹菜、香菜和胡萝卜中的关系。

3.5   CPP基因共线性分析和复制类型

使用MCScanX[12]进行串联分析。氨基酸序列使用Blastp分析，e值设置为1e-5。然后通过向MCScanX提交全基因组gff文件和blast的结果文件。使用duplicate_gene_classifier子程序鉴定复制类型。

3.6   CPP基因的进化分析

使用MAFFT对CPP基因对的编码序列（CDS）进行比对，并将比对文件转换为axt格式。使用Ka/Ks_calculator 2.0计算同义（Ks）和非同义（Ka）替换率。分歧时间使用公式T=Ks/2r估计。R表示中性替换率（5.2×10-9每个位点每年的替代次数）。

3.7   CPP基因表达分析

芹菜和香菜的不同组织中CPP基因表达的RNA-seq数据来自之前的研究[13-14]。以每百万碱基对转录物序列的每千字节片段（FPKM）表示的表达數据经过对数转换后用于聚类分析。使用TBtools进行层次聚类分析。

参考文献：

[ 1 ] Zefeng Yang，Shiliang Gu，Xuefeng Wang.et al. Molecular evolution of the CPP-like gene family in plants： insights from

comparative genomics of Arabidopsis and rice[J].J Mol Evol，2008，67（3）：266-277.

[ 2 ] 王凯. 拟南芥和水稻CPP转录因子家族的生物信息学分析[J].生物技术通报，2010（2）：76-84.

[ 3 ] Maljaei Mohammad Bagher，Moosavian Seyedeh Parisa，Mirmosayyeb Omid，et al. Effect of celery extract on thyroid function;Is herbal therapy safe in obesity[J].Int J Prev Med，2019（10）：55.

[ 4 ] 杨如兴，王鹏杰，陈芝芝，等.茶树CPP转录因子家族的全基因组鉴定及分析[J].西北植物学报，2019，39（6）：1024-1032.

[ 5 ] 黄静，郑晶，胡乐佳，等. 陆地棉CPP转录因子家族全基因组鉴定及分析[J/OL].分子植物育种：1-11[2021-08-24].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210127.1655.012.html.

[ 6 ] 薛正刚，王树杰，郜战宁，等.大麦HvCPP转录因子家族的全基因组鉴定与分析[J/OL].分子植物育种，2021，19（9）：2811-2818.

[ 7 ] Wang Wanpeng，Sijacic Paja，Xu Pengbo，et al. Arabidopsis TSO1 and MYB3R1 form a regulatory module to coordinate

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[ 8 ] Song X，Nie F，Chen W，et al.Coriander genomics database： a genomic， transcriptomic，and metabolic database for coriander[J].Hortic Res，2020，7（1）：55.

[ 9 ] Finn Robert D，Tate John， Mistry Jaina，et al. The Pfam protein families database[J]. Nucleic Acids Res，2008，32（1）：138.

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[ 11 ] Nguyen Lam-Tung，Schmidt Heiko A，von Haeseler Arndt， et al. IQ-TREE： A fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum-likelihood phylogenies[J].Mol Biol Evol，2015（1）：268-274.

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[ 13 ] Wang Yupeng，Tang Haibao，Debarry Jeremy D，et al. MCScanX： a toolkit for detection and evolutionary analysis of gene

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[ 14 ] Dapeng Wang，Yubin Zhang，Zhang Zhang，et al. KaKs_Calculator 2.0：A toolkit incorporating gamma-series methods and sliding window strategies[J].Genomics，Proteomics & Bioinformatics，2010，8（1）：77-80.