近视患者角膜在体与离体生物力学特性相关性初步研究△

薛超 王雁 向尧齐 沈岷 吴迪

角膜的生物力学性质被定义为在承受外界压力时如何反应和变形[1]。以往的研究表明，角膜生物力学特性对于角膜屈光手术的最终结果和可预测性至关重要[2-3]，并在眼压测量、青光眼管理以及角膜病变(如圆锥角膜、Fuchs角膜内皮营养不良)等方面发挥着重要作用。角膜生物力学特性近年来已成为研究的热点[4]。 单轴拉伸试验将特定方向的角膜试件进行测试，获取精确的角膜应力-应变关系，被认为是机械工程的金标准[5]。但是，这种测试是破坏性的，只能在离体组织中进行，不能在正常人角膜中使用。角膜生物力学参数的在体测量能够检测其在外力作用下如何发生改变。Corvis ST角膜生物力学分析仪能在体记录角膜变形及反应的整个过程,并能够直接分析角膜形变来评估角膜生物力学参数。但在体测量的角膜生物力学参数与离体角膜生物力学参数之间的关系到目前为止仍然还不清楚。

近年来，随着飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术(SMILE)的出现，我们能够获得正常人角膜组织，这使得直接研究正常人离体角膜组织成为可能。另外，我们可以使用Corvis ST角膜生物力学分析仪获得同一个体的在体角膜生物力学参数。因此，结合这两方面的数据，或许我们可以更全面地了解近视患者在体和离体角膜生物力学特性之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料本研究入选近视患者共23例(46眼)，其中，男10例、女13例。对所有研究对象术前进行严格规范的检查，包括裸眼视力、裂隙灯显微镜、直接检眼镜、间接检眼镜、角膜地形图、眼压、散瞳及小瞳验光等检查。排除标准：圆锥角膜或可疑圆锥角膜，活动性的眼部及全身疾病，眼部手术史、外伤史以及其他影响角膜健康的疾病，以保证手术的安全性；配戴软性角膜接触镜者停戴时间需大于2周、配戴硬性角膜接触镜者停戴时间需1个月以上。

所有入选对象SMILE术前1 d均使用Corvis ST角膜生物力学分析仪(Oculus Optikgeräte GmbH,Wetzlar,德国) 进行在体角膜生物力学参数测量。SMILE术后，将术中获取的角膜基质透镜进行单轴拉伸试验来获取其标准的力学特性。 本研究遵守《赫尔辛基宣言》，并获得天津市眼科医院伦理委员会的批准。所有研究对象进行检查和手术前均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 Corvis ST 角膜生物力学分析仪测量被检查者坐在设备前，将下颌放在颌托上，额部靠在额托上。通过调整操纵杆，使被检查者能够看到应该凝视的红灯[6]。在适当的时候空气脉冲会自动启动，检查完成后会自动将数据输出到连接的计算机上。 测量均由同一位有经验的技师完成，连续测量3次。质量指标“OK”的检查结果被纳入分析，取连续测量3次的平均值用于分析。

1.2.2 SMILE 手术过程所有手术均由同一位有经验的医师完成。术前3 d常规每天4次滴3 g·L-1氧氟沙星滴眼液，术前使用盐酸奥布卡因滴眼液滴眼进行表面麻醉。SMILE手术使用VisuMax型飞秒激光器(德国Carl Zeiss公司)完成；频率为500 kHz，能量为115～130 nJ，角膜帽厚度为110 μm，角膜基质内透镜直径为6.00～6.50 mm，角膜帽直径为基质内透镜直径加1.00 mm，侧切角均为90°。SMILE术中先进行微透镜下方扫描，然后行透镜侧切，再行透镜上方扫描，于12点钟位制作宽3 mm微切口；基底厚度为10～15 μm。扫描结束后用显微分离器先分离透镜前表面和上方角膜组织，再分离透镜后表面，将其游离后用显微镊取出，并仔细检查角膜基质透镜是否完整[7-9]。

1.2.3 试件制作和单轴拉伸试验SMILE术中取出角膜基质透镜后，用龙胆紫标记12点钟位，然后立即放入角膜保存液(Eusol-C，Alchima,Padova,意大利)中置于4 ℃的冰箱中保存，保存时间不超过 24 h。开始实验时，将角膜基质透镜置于橡胶垫上展平，再使用自制双刃刀沿上方-下方(垂直)方向裁切成宽1 mm的角膜试件。将试件夹持于夹具上，两端用带有螺纹的夹头用螺丝固定夹紧，先对试件进行预调，然后使用力学试验系统进行试验，以0.01 mm·s-1的速度进行单轴拉伸直至试件断裂。单轴拉伸试验在室温下进行，使用生理盐水水浴装置保持试件的湿润。本研究采用凯尔原位拉压力学试验系统[IBTC-50,凯尔测控试验系统(天津)有限公司]。

1.2.4 弹性模量计算方法分析单轴拉伸试验前面的小区域(对应小于5%的应变)，通过线性回归分析确定杨氏模量(E)。本研究中使用σ=A(eBe-1)描述应力应变关系，使用E=B(σ+A)推导弹性模量的线性关系。

1.3 统计学方法本研究使用SPSS 20．0统计学软件进行统计分析。应用Pearson相关分析法分析变量之间的相关性。采用多元线性回归分析法探讨弹性模量与测量的动态角膜反应(DCR)参数之间的关系。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 一般结果23例(46眼)近视患者的基本参数见表1。Corvis ST角膜生物力学分析仪测量得到的17个在体DCR参数见表2。单轴拉伸试验中，应力为0.02 MPa时，对应的弹性模量为(1.26±0.71)MPa(图1)。

2.2 相关分析结果单轴拉伸试验和Corvis ST角膜生物力学分析仪测量得到的DCR参数之间的相关性结果见表3，结果表明，除最大的偏离幅度(DefAMax)、弦长变化量和反向凹面半径外，其余DCR参数与单轴拉伸试验得到的弹性模量均显著相关(均为P<0.05)。

表1 近视患者的基本参数

表2 Corvis ST测量得到的DCR参数

图1 弹性模量计算中的实验数据和拟合曲线

表3 弹性模量与Corvis ST测量参数间相关性分析结果

表4 被纳入回归方程的相关影响因素的回归系数

3 讨论

角膜基质由数百层胶原板层构成，每一层由相互平行的胶原纤维和细胞外基质组成[10-11]。角膜基质占据了90%角膜厚度，其决定了角膜的生物力学特性。 因此，可以通过研究角膜基质的生物力学特性来了解角膜的生物力学性质。

弹性模量是评估角膜生物力学性能的重要参数，它被定义为应力-应变曲线的斜率，描述了在特定条件下载荷(应力)影响材料形变(应变)的程度。弹性模量越高，材料越硬，较硬的材料需要更大的力量才能发生变形[12]。眼压是角膜生物力学评估中一个较为复杂的变量，较软的角膜在较高眼压下，可能比较硬的角膜在较低的眼压下表现出更硬的生物力学特性[12]。 bIOP是生物力学校正眼压，它是考虑中央角膜厚度、年龄和DCR参数的影响，通过有限元模拟推导出来的，已经得到实验和临床的验证[13-14]。本研究中近视患者的bIOP为(15.08±1.67)mmHg。根据以往研究发现，该眼压水平接近于应力0.02 MPa时的眼压[15-16]。因此，本研究中选取了应力为0.02 MPa时对应的弹性模量。本研究中离体角膜弹性模量为(1.26±0.71)MPa，与Wollensak等[17]对人眼球摘除后角膜弹性模量的研究值相近。 另外，本研究利用Corvis ST测量得到的17个在体DCR参数平均值、范围和95%置信区间与以前的研究结果相接近[18-22]。相关性分析结果显示，Corvis ST测量得到的大部分DCR参数与单轴拉伸试验得到的弹性模量显著相关；并且，研究结果发现，DefAMax(ms)、弧长变化量、反向凹面半径与弹性模量均无显著相关性(均为P>0.05)。 由于这些参数的复杂性，需要今后进一步研究。

DAMax为最大压陷时变形幅度，本研究显示其与弹性模量呈负相关。以往有研究报道[23-24],圆锥角膜的DAMax与正常角膜相比更大，这表明较硬的角膜DAMax较小，与本研究结果一致。 Roberts等[18]发现，正常角膜较圆锥角膜更硬，表现为较长的A1Time和较慢A1Velocity。Huseynova等[1]发现，较硬的角膜预示着较大的最大压陷时曲率半径，回弹较快，从而导致第2次压平时间较短，但在恢复期第2次压平速度较快。与此相一致，本研究发现角膜弹性模量与A1Time、第2次压平速度和最大压陷时反向曲率半径均呈正相关，而与第2次压平时间和A1Velocity均呈负相关。

最大压陷时峰距为最大凹度时角膜颞侧-鼻侧截面的两个最高点之间的距离[25]，较硬的角膜最大凹陷时峰距较短[18]。以往有研究证实[13,19]，较软的角膜DA比较高。 本研究发现弹性模量与最大凹陷时峰距、DA比2 mm、DA比1 mm均呈负相关。

DefAMax是最大的偏离幅度，弧长变化量是另一个DCR参数，用于描述从初始状态到最大凹陷时，从角膜顶点到3.5 mm范围两侧的弧长改变[13]。Roberts等[18]发现，正常人角膜中DefAMax(mm)改变与弧长变化量相一致。具有较大的抗变形能力的角膜在承受外界压力时，DefAMax(mm)较小，弧长缩短较小。由此可以得到弹性模量应该与DefAMax(mm)和弧长变化量均呈负相关。同时，更高的DefAMax(mm)意味着更长的DefAMax(ms)。本研究结果与以上研究结果相一致。

反向凹面半径是在角膜发生形变的凹面阶段反向曲率半径最大值的倒数，较软的或扩张的角膜具有较大的反向凹面半径[19]。综合半径随着角膜硬度的减小而增加[20]。水平方向Ambrosio相关厚度是一个新的DCR参数，较低的值表明较薄的角膜和(或)从中央到周边角膜厚度增加得更快[13]，提示角膜较软。本研究发现，角膜弹性模量与综合半径呈负相关，与水平方向Ambrosio相关厚度呈正相关。

角膜硬度被定义为校正的气体压力值与生物力学校正眼压的差值除以角膜的偏移。角膜硬度参数A1(SP-A1)使用未变形时与A1Time角膜的偏移幅度，SP-HC使用从A1Time到产生最大压陷的时间期间的偏移变化[18]。 Lee等[20]发现，较小的SP-A1和SP-HC与角膜硬度下降或抗变形能力降低相一致。由此可以推断，弹性模量与SP-A1和SP-HC均呈正相关。

我们使用测量获取的DCR参数，初步构建了预测获取角膜基质弹性模量的模型，使用此模型来初步评估人眼角膜生物力学特性。在本研究中，最适合的模型可以解释98.9%的变量。在该模型中，A1Time是弹性模量的主要预测指标；另外，A1Velocity、DefAMax(ms)和SP-HC也被纳入了该模型。可以通过检查未调整和调整的R2值之间的差异(0.990 和0.989)来评估回程方程的稳健性。0.001的差异表明，如果该方程式来自更大的样本量，那么差异仅减少0.1%[26]。

综上所述，本研究首次尝试探讨近视患者角膜在体与离体生物力学参数之间的关系。从离体角膜生物力学参数的角度对临床生物力学测量DCR参数的内在意义进行了研究，发现测量得到的角膜基质组织的弹性模量与Corvis ST角膜生物力学分析仪测量获取的大部分DCR参数显著相关。将来有可能使用DCR参数通过回归方程预测近视患者角膜的弹性模量。但我们也应该认识到，虽然可以通过研究角膜基质透镜的生物力学特性来了解角膜的生物力学性质，但由于不同深度的角膜基质生物力学强度存在差异，本研究测量得到的角膜基质透镜的弹性模量跟真实的全基质和全角膜弹性模量可能还存在一定的差距，这是本研究的局限之处。将来需要更大样本量、更深入的研究来进一步了解近视患者角膜生物力学特性。