多种香型白酒中氨基甲酸乙酯残留含量的研究

黄 松，黄小清，张 辉，刘 佳，王 宇，谭锦萍，彭 程

（广州市食品检验所，广东广州 511400）

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate,EC）又叫尿烷，是食品发酵过程中自然产生的物质，广泛存在于酸奶、酱油、酒类等众多发酵食品之中[1-2]。1943年科学家首次发现该物质在动物实验中能引起受试动物多部位癌变[3]，国际癌症研究机构2007 年将其归入2A 可能人类致癌物清单中[4]。EC 主要由乙醇和氨甲酰化合物发生反应生成，常见的氨甲酰化合物有尿素、瓜氨酸、氨甲酰磷酸、氰酸及焦炭酸二乙酯[5]。白酒中EC的产生途径主要有两种：一是尿素与乙醇反应产生EC，尿素主要来自于环境或在发酵过程中由微生物产生[6-7]；二是氰化物被氧化成氰酸盐与乙醇反应生成EC，氰化物由原料中的氰糖苷经酶解反应或高温裂解而形成[8-11]。同时，在酒类生产的不同阶段EC 产生的主要原因不同。在发酵阶段，EC主要由尿素和乙醇反应生成[12]；在蒸馏阶段，高温和酸性条件下，尿素和氰化物均与乙醇反应形成EC[11，13]；在储存熟化阶段，在温度和金属离子的催化下，EC主要由氰化物生成[14-15，9]。

早在1985 年，加拿大就规定了威士忌中EC 的限量标准是150 μg/L，随后美国、日本、巴西等国家也出台了关于EC的限量标准。我国于1993年公布了首个EC检验标准SN 0285—1993《出口酒类中氨基甲酸乙酯残留量检验方法》，随后又发布了GB 5009.223—2014《食品中氨基甲酸乙酯的测定》，但是并没有制定出相应的最大残留限量标准。白酒是我国传承悠久的酒类品种，以其独特的风味和口感深受民众喜爱，控制白酒中氨基甲酸乙酯的残留含量对消费者的健康具有重要的意义。本试验采用液液萃取提取出白酒中的EC，以GC-MS 法进行定量，检测了一批白酒基酒样品和市售的白酒样品中EC 的含量，同时对比了不同香型白酒和不同等级白酒的EC残留含量的情况，首次发现EC的平均含量随着白酒等级的降低而减小的规律，为我国白酒中EC的限量标准的制定提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：白酒基酒样品购于广州市场，主要包括11 个香型的183 个样品。成品白酒购于广州市场，主要包括5个香型的47个不同等级的样品。

试剂及耗材：氨基甲酸乙酯（99%），阿拉丁公司；氨基甲酸乙酯-D5（99.8%），上海安谱；乙酸乙酯、甲醇（色谱纯），美国Fisher Chemical 公司；乙醚（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；氯化钠（分析纯），广州化学试剂厂；无水硫酸钠（色谱纯），阿拉丁公司。

仪器设备：6890-5975C 气相色谱质谱仪，美国Agilent公司；DB-WAX气相色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），美国Agilent 公司；Allegra X-30R Centrifuge 高速离心机，美国Beckman 公司；MS3 涡旋振荡器，德国IKA 公司；ME2002E 电子天平，瑞士Mettler Toledo 公司；2600TH 数控超声波清洗器，上海安谱实验科技股份有限公司；Organomation NEVAP 112氮吹仪，美国Organomation公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

准确称取一定含量的EC 和EC-D5 于不同容量瓶中，用甲醇定容，得到浓度为1000 mg/L的标准储备液，-18 ℃下储存备用。使用时将标准储备液用甲醇稀释得到10 mg/L和1.0 mg/L的中间液。

准确吸取0.05 m、0.1 m、0.5 mL浓度为1.0 mg/L EC 中间液和0.10 m、0.20 m、0.50 m、1.00 mL 浓度为10 mg/L EC 中间液于不同的容量瓶中，再各加0.2 mL 浓度为10 mg/L 的EC-D5 中间液，用甲醇定容至10 mL，得到5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL的标准点，其中EC-D5的浓度为200 ng/mL。

1.2.2 提取

参照文献报道的前处理方法[16]，准确称取2.00 g（精确到0.01 g）样品于15 mL离心管中，加入内标后再加入0.5 g氯化钠到离心管中，加盖超声20 min，向离心管中加入2 mL 5%乙酸乙酯乙醚溶液（5∶95，v∶v）进行萃取，涡旋3 min，6000 r/min 离心3 min，上清液转移至装有5 g无水硫酸钠的15 mL离心管中。反复萃取3次，合并上清液，涡旋3 min，6000 r/min离心3 min，上清液转移至15 mL 离心管中，常温下氮气吹至近干，1 mL 甲醇定容，涡旋，过0.22 μm 有机滤膜装瓶备用。

1.2.3 仪器条件

气相色谱条件：毛细管色谱柱：DB-WAX，30 m×0.25 mm×0.25 μm；进样口温度220 ℃，进样量1 μL，不分流进样；载气为氦气（99.999 %），恒定流量1.0 mL/min；程序升温：初温50 ℃，保持1 min，以8 ℃/min 升温至120 ℃，然后以1 ℃/min升至130 ℃。

质谱条件：电离模式，EI（electron impact）；离子源温度230 ℃，传输线温度250 ℃，四级杆温度250 ℃；检测方式，选择离子监测（SIM）；EC 的选择监测离子（m/z）44、62、74、89，定量离子62；EC-D5选择监测离子（m/z）64、76，定量离子64。

2 结果与分析

2.1 EC的检测方法

2.1.1 方法线性、检出限、定量限

对1.2.1 部分所述的标准点进行检测，建立标准曲线，线性相关系数为Y=1.003X+0.01856，R2=0.99994，表明在5～1000 ng/mL 范围内线性良好。通过样品基质加标来确定检出限和定量限，将加标样品逐级稀释至其分别满足3 倍和10 倍信噪比，得到检出限为0.2 μg/kg，定量限为0.6 μg/kg。

2.1.2 加标回收率、精密度

选取一个市售白酒样品作为基质，在此基础上做加标回收实验，加标5 μg/kg、25 μg/kg、100 μg/kg 3 个水平，每个水平重复6 次，加标回收结果和相对标准偏差（RSD）见表1。结果表明，基质样品的EC平均含量为22.48 μg/kg，3 个不同水平的加标平均回收率为91.3 %～105.4 %，RSD 为0.33 %～1.90 %，说明该方法精确性和准确性良好，满足实验需要。

表1 EC的加标回收结果及其相对标准偏差(n=6)

2.2 白酒基酒样品中EC检测结果与分析

2.2.1 白酒基酒样品的检测结果

取183个白酒基酒样品进行EC含量的测试，实验结果总结如表2 所示，所测试的基酒样品中，EC的检出率为100%，其范围为3.01～544.74 μg/kg，平均值为178.90 μg/kg，该结果与此前文献报道的信息保持一致[14]。

表2 白酒基酒样品的EC值

2.2.2 不同香型白酒样品EC平均值的比较

统计11 种香型的白酒基酒样品的EC 平均值，可以得到图1。由图1 可知，米香型白酒基酒样品的EC平均含量最低，为39.30 μg/kg，其次是豉香型（61.98 μg/kg）和清香型（88.06 μg/kg）；浓香型的EC 平均含量最高，为322.09 μg/kg，其次是凤香型（267.86 μg/kg）和芝麻香型（199.77 μg/kg）。米香型、豉香型白酒主要以大米为原料，具有醪液发酵的酸度不大、发酵温度低、发酵时间短等特点，这些条件较为温和，故而EC的生成量较少[17-18]。清香型白酒基酒样品的EC 值范围为3.01～213.31 μg/kg，该类型白酒中EC 的含量波动范围较大，是因为其发酵条件温和，产生的EC并不多，但是在储存过程中受光照、温度、金属离子等条件的影响，可以形成大量的EC，导致最后含量升高[19-20]。浓香型白酒多采用多菌种发酵，使用小麦、豌豆等高蛋白质含量的原料，加之入库储存时间长而形成大量EC[21-22]。凤香型和芝麻香型白酒的发酵工艺多具有高酸度、高氮配比、中高温复合用曲、长时间连续发酵等特点，使得酒样中EC含量升高[23-25]。

图1 不同香型白酒基酒样品的EC平均值

2.2.3 不同等级白酒样品的EC平均值的比较

白酒基酒样品经过专业感官评定人员按照感官评价标准进行评价打分后分成优级、一级和二级三个级别，比较各个香型白酒3 个等级的EC 平均值（见图2）可知，大部分白酒的EC 值随着等级的降低而减小。这可能是因为EC 的含量与白酒样品中总酸总酯的含量变化趋势保持一致，特级白酒的总酸总酯含量高，同时EC 的含量也相对较高。但是，特香型白酒样品不符合这一趋势，原因有待进一步研究。

图2 各个香型不同等级白酒的EC平均含量

2.3 市售白酒样品的EC检测结果与分析

分析市售的5 种香型47 个白酒样品的EC 含量，得到结果如表3 所示。所有样品中EC 的检出率为100 %，其范围为2.82～192.67 μg/kg，平均值为52.79 μg/kg。其中含量最高的是酱香型白酒，其次是浓香型、豉香型、清香型，米香型最低。市售成品白酒的EC 平均含量远小于白酒基酒样品中EC平均含量，这表明白酒从基酒经过勾兑之后变成成品酒，其EC的含量有较大幅度的减小。

表3 不同香型的市售白酒样品EC值

购买的成品白酒包括豉香型、酱香型、米香型、浓香型和清香型等5 种香型的3 个等级酒样，分析其中EC 含量可得图3。由图3 可知，白酒中EC 的含量随着其等级的降低而减小，该趋势与白酒基酒样品中的EC含量变化趋势吻合。

图3 市售白酒样品不同等级的EC平均值

3 结论

采用液液萃取提取结合GC-MS 定量检测，分析了183 个白酒基酒样品和47 个市售白酒成品样品中EC的残留含量。结果表明，两种酒样中EC的检出率均为100%，说明白酒样品中EC 的残留是普遍存在的。不同类型的白酒基酒样品中的EC 值差异较大，表明白酒的生产工艺和储存条件对酒样中EC 的残留含量有很大的影响。白酒基酒样品中，EC 含量最高的3 种是浓香型、凤香型和芝麻香型白酒，含量最低的3 种是米香型、豉香型和清香型。市售成品白酒样品中酱香型EC含量最高，米香型最低。成品白酒的EC 平均含量为52.79 μg/kg，远低于白酒基酒样品的178.90 μg/kg，说明经过勾兑后成品白酒样品中EC 的平均含量有较大幅度的降低。但是考虑到白酒在我国的受欢迎程度和EC 的潜在危害性，白酒样品中EC 高残留的问题仍亟待解决。