劳拉西泮片有关物质的色谱-质谱结构鉴定

祝 颂，姜 净，刘 洋，邹文宇，胡芃薇，陆宇婷，宋 敏，杭太俊

（中国药科大学药物分析系，南京 210009）

劳拉西泮［7-氯-5-（2-氯苯基）-1，3-二氢-3-羟基-2H-1，4-苯并二氮杂䓬2-酮，lorazepam，合成路线见图1］属于苯二氮䓬类精神安定药，具有镇静、催眠和抗癫痫等作用［1］，因其疗效良好和起效较快［2］，既被广泛用于抑郁症治疗［3-4］，也是一线抗癫痫持续状态的首选药物［5］。

Figure 1 Typical synthetic routes for lorazepam

虽然劳拉西泮原料药及其制剂的有关物质已被多国药典［6-7］收载（见图2），质量研究报道［8］主要阐述劳拉西泮有关物质分析方法的建立与验证［9-11］，但是，劳拉西泮杂质谱的系统研究与鉴定尚未见报道。

本研究以劳拉西泮临床常用片剂为对象，建立了适用于劳拉西泮有关物质检查的色谱-质谱联用分析方法，通过高分辨Q-TOF/MS测定了劳拉西泮有关物质的准确相对分子质量及分子式，结合MS/MS的子离子特征，综合解析鉴定了各有关物质的结构，可为劳拉西泮的质量控制提供参考依据。

Figure 2 Lorazepam known related substances listed in EP and USP

1 材料

1.1 试 剂

劳拉西泮片（湖南洞庭湖药业股份有限公司，批号B2006043），工艺有关物质对照品（自制，杂质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和EP10有关物质B（EP-B），图3）。乙酸铵、冰醋酸（AR级，南京化学试剂有限公司），乙腈（HPLC级，德国默克公司），去离子水（市售娃哈哈纯净水）。

1.2 仪 器

岛津LC-MS-9030四极杆飞行时间质谱仪、Lab-Solutions数据处理系统（日本岛津公司）；BS21S分析天平（德国Sartorius公司）。

2 方法

2.1 色谱方法

InertSustain C18色谱 柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相A相为0.1%冰醋酸-20 mmol/L乙酸铵缓冲溶液，B相为乙腈，线性梯度洗脱（A∶B）：0 min（70∶30）→40 min（10∶90）→60 min（10∶90）→61 min（70∶30）→70 min（70∶30），流 速1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长230 nm，进样量20µL。

Figure 3 Chemical structures of lorazepam process related substances

2.2 质谱条件

电喷雾正离子化，高分辨Q-TOF/MS测定，NaI溶液（400µg/mL）准确质量校正。喷雾电压4.0 kV，雾化气压力230 kPa，流量3 L/min，接口温度300℃，加热气流量10 L/min，干燥气流量10 L/min，氩气CID碰撞能量5~45 eV，扫描范围m/z50~1 500。

2.3 溶液配制

供试品溶液：取劳拉西泮片粉适量（约相当于劳拉西泮2 mg），精密称定，置10 mL量瓶中，加乙腈适量，超声使劳拉西泮溶解，再以流动相稀释至刻度，摇匀，以0.45µm有机系滤膜过滤，取续滤液即得质量浓度为0.2 mg/mL的供试品溶液。精密量取上述溶液适量，加流动相定量稀释，配制0.1%的自身对照溶液。

对照品溶液：取工艺有关物质对照品（杂质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和EP-B）各适量，分别精密称定，加适量乙腈溶解，并用流动相定量稀释制成质量浓度均约为0.2µg/mL的混合溶液，作为有关物质的对照品溶液。

强制降解试验溶液：取劳拉西泮片粉适量（约相当于劳拉西泮2 mg），加1.0 mol/L盐酸1 mL并于40℃水浴放置90 min，或加0.1 mol/L氢氧化钠溶液1 mL并于30℃水浴放置4 h，或加30%过氧化氢溶液1 mL并于40℃水浴放置12 h，或于90℃烘箱中放置4 h，或加水1 mL并于光照4 500 lx放置10 d分别处理。放冷（酸碱处理溶液先中和）后，分别加乙腈适量，振摇使劳拉西泮溶解，并加流动相稀释至约10 mL，以0.45µm有机系滤膜过滤，取续滤液作为劳拉西泮质量浓度约为0.2 mg/mL的强制降解试验溶液。并以溶样溶剂为空白。

3 结果

3.1 有关物质检查

建立的挥发性流动相HPLC分析法，适用于劳拉西泮片有关物质检查和联用质谱鉴定。图4为劳拉西泮片及其强制降解试验溶液的HPLC-UV谱图。采用0.1%自身对照法计算有关物质的含量，按保留时间由小到大顺序对含量大于0.1%主要有关物质进行识别和编号。

强制降解试验表明（表1），本品对强酸、强碱、氧化、强光照射、干热条件均不稳定，共分离并检出22个主要有关物质。其中，劳拉西泮片供试品中检出3个有关物质（图4-d，有关物质3、18和20）；光照破坏形成2个主要降解产物（图4-e，有关物质10~11）；碱破坏形成2个主要降解产物（图4-f，有关物质3和9）；酸破坏形成8个主要降解产物（图4-g，有关物质3、5、11~13、16~17和20）；高温破坏形成7个主要降解产物（图4-h，有关物质3、14~15和19~22）；氧化破坏形成9个主要降解产物（图4-i，有关物质1~2、4、6~8、10~11和18）。

3.2 有关物质的结构鉴定

采用高分辨Q-TOF/MS测定各有关物质的母离子及子离子的准确质量和元素组成，以及它们的二级质谱特征碎片，并通过与劳拉西泮和已知有关物质的质谱特征的对比分析，鉴定各主要有关物质的结构。结果见表2和图5-6。其中，有关物质3，5，12，14和17的结构，经鉴定分别与药典已知杂质USP-D、EP-D、EP-C、USP-E和USP-B的结构相对应。

3.2.1 已知有关物质的确证 通过有关物质HPLC定位、DAD共轭体系（图7）比对及质谱定性（图8），确证有关物质3、14和17分别与USP43规定的已知有关物质D、E和B对应；有关物质5和12分别与EP10规定的已知有关物质D和C对应。

Figure 4 HPLC chromatograms of lorazepam tablets and its stressed test solutions

Table 1 Mass balance of lorazepam tablets and its stressed test solutions

劳拉西泮及已知有关物质紫外共轭体系规律如下：（1）劳拉西泮、对照品Ⅰ和EP-B及有关物质5和12母核结构为苯并二氮杂䓬环，λmax在230 nm左右；（2）有关物质3和14母核结构为苯并哌嗪环，由原苯并二氮杂䓬环酰胺基水解开环重排形成，共轭体系无明显差异，λmax也在230 nm左右；（3）对照品Ⅱ和Ⅲ及有关物质17母核结构为二苯酮，由原苯并二氮杂䓬环亚胺基水解开环并氧化形成，共轭体系有较大差异，除λmax在230 nm左右外，250 nm处有明显的肩峰。

劳拉西泮及已知有关物质MS/MS裂解规律如下：（1）劳拉西泮及其有关物质12和14的母离子中，苯并二氮杂䓬环或苯并哌嗪环上的羟基脱水，生成质量数少18的特征碎片离子；（2）劳拉西泮及其有关物质5和12的母离子中，苯并二氮杂䓬环上的羟基脱水和羰基脱落，生成质量数少46的特征碎片离子；（3）劳拉西泮的上述特征碎片离子及其有关物质5和17的母离子中，苯环上可脱去HCl与邻苯形成五元环，生成质量数少36的特征碎片离子。

根据劳拉西泮及已知有关物质的这些结构特征，并结合已有报道文献分析［12-13］，可以辅助其未知有关物质结构的分析鉴定。

3.2.2 未知有关物质的确证 对于各未知有关物质，根据其HPLC保留行为、DAD及质谱特征、及其与劳拉西泮或已知有关物质的差异，结合合成和制剂工艺路线分析，可鉴定结构。

有关物质1和2为劳拉西泮保留较弱的特征氧化降解杂质。测得它们的［M+NH4］+的准确离子质量分别为592.212 7和576.219 1，相应离子组成分别为C27H34N3O12+和C27H34N3O11+，与分子结构中引入多羟基糖苷结构相应。所以，两氧化杂质的极性明显较大，反相色谱保留显著减弱，推定为劳拉西泮氧化水解形成的芳伯胺产物进一步与片剂辅料乳糖发生美拉德反应生成的降解杂质。DAD图显示它们与有关物质9和10有趋同性，表明二者母核均为氮杂䓬环酰胺基水解开环产物。二者二级质谱裂解途径类似，其中有关物质1 MS/MS主要特征碎片离子（图9）为m/z575.185 4（C27H31O12N2+）和547.191 3（C26H31O11N2+）分别与［M+NH4］+脱去NH3、进一步脱去羰基相应，205.075 7（C14H9N2+）和177.041 9（C12H5N2+）分别与［M+NH4］+脱去乳糖和2分子羟基、进一步脱去乙烯（CH2=CH2）相应，133.035 2（C7H5ON2+）与氮杂䓬环重排形成的碎片离子相应。故推断有关物质1为过氧化条件下，劳拉西泮1，2位酰胺基水解开环并进一步氧化脱水成炔、苯环上氧化水解脱氯成酚并脱水成环，生成的芳伯胺降解物与1分子乳糖发生美拉德反应形成的产物；而有关物质2为有关物质1未经N氧化的产物。

Table 2 Related substances identified in lorazepam tablets by LC-Q-TOF/MS

有关物质4、6、7和8为劳拉西泮的氧化降解杂质。测得［M+H］+的准确离子质量均为337.014 6，均与离子式C15H11O3N2Cl2+相应，为同分异构体，与劳拉西泮元素组成相比，多1个O元素。MS/MS主要特征碎片离子与劳拉西泮相应碎片也多1个O元素，它们的DAD均基本相同（图10）。所以，它们均保留了劳拉西泮苯并二氮杂䓬环的基本共轭结构形式。故推断有关物质4、6、7和8为劳拉西泮的氮氧化的同分异构产物，这与劳拉西泮氮杂䓬环上1，4位均易N氧化的特征相应。根据保留时间与极性的相关性，推定有关物质4和6为劳拉西泮1位羟胺化的主要立体异构杂质，7和8为劳拉西泮4位N氧化的主要立体异构杂质。

有关物质9和10在碱性和光照、氧化破坏条件下均可产生。测得［M+H］+的准确离子质量分别为338.046 0和325.014 6，与离子式C15H14O2N3Cl2+和C14H11O3N2Cl2+分别相应。DAD图显示二者共轭体系不同于劳拉西泮和对照品Ⅱ，表明二者母核结构既无氮杂䓬环，也非二苯酮类。而是氮杂䓬环酰胺基水解开环形式。其中有关物质10 MS/MS主要特征碎片离子（图11）为m/z307.001 9（C14H9O2N2Cl2+）和197.010 1（C8H6O2N2Cl+）分别与［M+H］+脱去H2O、进一步脱去氯代苯相应，279.007 0（C13H9ON2Cl2+）与［M+H］+脱去H2O和羰基相应，与氮杂䓬环上的羟基脱水和羰基脱落裂解规律一致。另外4位N为叔胺相较1位N更易氧化成氮氧化物。故推断有关物质10为劳拉西泮1，2位酰胺基水解开环脱羧后，3位醇羟基氧化成羧酸并4位N氧化的产物；而有关物质9为劳拉西泮1，2位酰胺基水解开环后，2位羧基酰胺化的产物。

Figure 5 Chemical structures of lorazepam and its related substances 1-22

有关物质13为劳拉西泮的特征酸降解杂质。测得［M+H］+的准确离子质量为307.040 2，与离子式C15H13ON2Cl2+相应；与劳拉西泮元素组成相比，少1个O元素并多2个H元素。MS/MS主要特征碎片离子（图12）为m/z290.001 8（C15H10ONCl2+）和262.017 2（C14H10NCl2+）分别与［M+H］+脱去NH3、进一步脱去羰基相应，279.006 9（C13H9ON2Cl2+）与［M+H］+脱去乙烯（CH2=CH2）相应。其DAD图与有关物质17和对照品Ⅱ有趋同性。故推断有关物质13为劳拉西泮4，5位亚胺基水解开环后，酰胺羰基还原并重排脱水环合的产物。

有关物质15和18主要在高温和氧化破坏条件下产生。测得它们［M+H］+的准确离子质量分别为330.019 8和623.020 8，与离子式C16H10ON3Cl2+和C30H19O3N4Cl4+相应；有关物质15与劳拉西泮元素组成相比，多1个CN、少1个OH，提示可能氰基取代羟基，其中氰基可能为劳拉西泮七元环完全水解脱落的酰胺片段在高温环境下脱水而来。而有关物质18与2分子劳拉西泮元素组成相比，少1个H2O，提示可能脱水缩合。二者MS/MS主要特征碎片离子符合劳拉西泮氮杂䓬环裂解规律，DAD图也显示它们与劳拉西泮有趋同性，表明二者母核结构应为苯并二氮杂䓬环形式。故推断有关物质15为劳拉西泮的3位羟基被氰基取代的产物；而有关物质18为2分子劳拉西泮间的3位羟基脱水成醚二聚物。

Figure 6 MS/MS spectra of lorazepam and its related substances[M+H]+ions

有关物质11、16和20主要在氧化和酸破坏条件下产生。测得［M+H］+的准确离子质量分别为291.011 7、275.014 1和549.021 1，分别与离子式C14H9ON2Cl2+、C14H9N2Cl2+和C28H17N4Cl4+相应；其中有关物质16与3元素组成相比，少1个羧基，提示可能脱羧。DAD图显示它们与有关物质3有趋同性，表明三者母核结构为苯并哌嗪环形式。三者二级质谱裂解途径类似，其中有关物质16 MS/MS主要特征碎片离子（图13）为m/z239.035 8（C14H8N2Cl+）与［M+H］+脱去HCl与邻苯形成五元环相应，163.004 6（C8H4N2Cl+）与有关物质3的特征碎片离子相同，135.993 7（C7H3NCl+）和100.017 1（C7H2N+）分别与m/z163脱去HCN、进一步脱去HCl相应。故推断有关物质16为劳拉西泮1，2位酰胺基水解开环后，脱羧重排脱水环合的产物；而有关物质11为劳拉西泮1，2位酰胺基水解开环后，脱羧氧化脱氢环合的产物；有关物质20则为有关物质3和11与16的亲核偶联脱羧/水的产物。

Figure 7 DAD spectra of lorazepam and its related substances

有关物质19、21和22均为劳拉西泮的高温降解杂质。测得它们［M+H］+的准确离子质量分别为604.026 7、906.029 0和906.029 0，分别与离子式C30H18ON5Cl4+、C45H26O2N7Cl6+和C45H26O2N7Cl6+相应。其中有关物质19与1分子特征高温降解杂质有关物质14和1分子有关物质3元素组成相比，多1NH2，少1OH和1H2O，提示可能发生酰胺化和脱水缩合；其MS/MS主要特征碎片离子（图14）为m/z586.013 9（C30H16N5Cl4+）与劳拉西泮氮杂䓬环上羟基易脱水规律一致，287.012 6（C15H9N2Cl2+）和252.043 4（C13H12NCl2+）与有关物质14的特征碎片离子相同；其DAD图与有关物质14有趋同性。故推断有关物质19为有关物质14与酰胺化的有关物质3脱水偶联的产物。而有关物质21和22反相色谱保留显著增加，极性显著降低，无论DAD共轭体系还是质谱特征均一致（图15）为同分异构体，MS/MS主要特征碎片证明了它们的结构中同时包含劳拉西泮和1，3哌嗪杂质（3、11、14或16）的特征，故推断有关物质21和22为劳拉西泮与其1，3哌嗪杂质多次脱水偶联成的杂质异构。

Figure 8 MS/MS fragmentation pathways of[M+H]+ions of lorazepam and its typical known related substances

Figure 9 MS/MS fragmentation pathways of[M+NH4]+ions of related substance 1

4 讨论

本研究建立的劳拉西泮片有关物质挥发性流动相HPLC检查方法适用于劳拉西泮片有关物质的色谱-质谱联用鉴定。在建立的LC-MS联用鉴定条件下，劳拉西泮与各有关物质均得到有效的分离，共检测到22个含量大于0.1%的有关物质，经鉴定，其中5个与药典收载已知有关物质相对应，其余17个均为本研究首次鉴定的未知有关物质。

Figure 10 LC chromatogram（A）and EIC chromatogram（B）of related substances 4,6,7 and 8

Figure 11 MS/MS fragmentation pathways of[M+H]+ions of related substance 10

Figure 12 MS/MS fragmentation pathways of[M+H]+ions of related substance 13

Figure 13 MS/MS fragmentation pathways of[M+H]+ions of related substance 16

Figure 14 MS/MS fragmentation pathways of[M+H]+ions of related substance 19

Figure 15 LC chromatogram(A)and EIC chromatogram(B)of related substances 21 and 22

强制降解试验表明，在氧化降解条件下劳拉西泮易与辅料中的乳糖发生美拉德反应生成的降解杂质1和2。在酸降解条件下，劳拉西泮氮杂䓬环上亚胺基易水解开环并氧化为二苯酮类降解杂质，包括有关物质13和17。在酸、高温和氧化降解条件下，劳拉西泮氮杂䓬环既易发生酰胺基水解开环并重排形成苯并哌嗪环类降解杂质：3、11、14、16、18~22；又易形成N氧化降解杂质：4~8、12和15。在碱和光照降解条件下，劳拉西泮氮杂䓬环上酰胺基易水解开环形成二苯亚胺类降解杂质9和10。

总之，劳拉西泮片在极端条件下均不稳定，因此，应该注意关键制备工艺过程的控制，并建立相应的关键质量属性控制指标［14-15］。