自拟固胎煎对复发性流产小鼠蜕膜组织Foxp3、RORγt表达的影响

徐彩,周兰,黄海涛∗,黄文玲,张芸娜,左茜茜

复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)在我国被定义为：与同一个性伴侣在妊娠28周内有连续3次及以上的自然胚胎丢失。其发病率占生育期女性的1%～5%[1]。Treg/Th17的表达平衡是目前的研究热点。本团队在前期研究发现，补肾健脾、益气养血安胎中药自拟固胎煎可降低Th17/Treg比例，上调IL-10、TGF-β1的表达水平，下调IL-6、IL-17的表达水平，诱导免疫耐受，降低胚胎丢失率，改善妊娠结局[2]。在此基础上,本研究进一步观察中药自拟固胎煎对RSA小鼠蜕膜组织细胞形态的影响，并检测与Th17、Treg细胞分化机制密切相关的头翼状螺旋转录因子 3(forkhead/pterygoid spiral transcription factor 3，Foxp3)和维甲酸相关核孤儿受体(retinoic acid related nuclear orphan receptor，RORγt)蛋白的表达，继续探讨中药自拟固胎煎对RSA免疫平衡的影响。

1 实验材料

1.1 动物

8～10周龄SPF级CBA/J雌鼠自北京华阜康生物科技有限公司购进，共48只。8～10周龄SPF级DBA/2雄鼠20只，以及同周龄BALB/c雄鼠4只，均自北京维通利华生物科技有限公司购进。

1.2 药物

自拟固胎煎饮片购于北京中医药大学东方医院，药物组成包括：菟丝子、桑寄生、苎麻根、覆盆子、白术等。药物经煎制并减压浓缩,配制成含生药1.425 g/mL中药煎剂,-20℃备用。地屈孕酮片以蒸馏水稀释至浓度1.5×10-4mg/mL，存于-20℃备用。

1.3 试剂

一抗：Foxp3 antibody(英国 Abcam 公司，ab215206)，Rabbit Anti-ROR gamma T antibody(北京博奥森生物技术有限公司，bs-23109R)，内参β-Actin(D6A8) Rabbit mAb(CST，8457S)；二抗：Goat Anti-Rabbit IgG H&L(HRP)(英国 Abcam 公司，ab6721)；SDS-PAGE预制胶套装kit(MDL，911919)；苏木素染液(北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI-9609)。

2 实验方法

2.1 造模及分组

将CBA/J雌鼠与BALB/c雄鼠2：1合笼,建立正常妊娠模型(CBA/J×BALB/c组)作为对照组，CBA/J雌鼠与DBA/2雄鼠2∶1合笼,建立自然流产模型(CBA/J×DBA/2组)。检出阴栓的小鼠计为妊娠第0天。将流产模型小鼠随机分为5组：中药高、中、低剂量组、西药组以及模型组。每组8只。其中中药低、中、高剂量组分别给予含中药生药7.125、14.25、28.5g/kg煎剂(比例1∶2∶4)灌胃。对照组及模型组孕鼠分别予0.9%生理盐水灌胃；西药组以地屈孕酮溶液灌胃。各组灌胃药物灌均稀释至0.4 mL，每日灌胃1次，连续给药2周。孕14 d 断颈处死小鼠，解剖取出子宫内胚胎着床部位的蜕膜组织，以预冷的PBS冲洗干净，迅速置液氮中保存。

2.2 HE染色观察小鼠蜕膜组织细胞形态

取蜕膜组织投入预先配好的固定液中(10%福尔马林)固定24 h以上后酒精脱水、石蜡包埋、切成薄片；用二甲苯脱蜡(二甲苯I 10 min，二甲苯II 10 min)、梯度酒精(100% 3 min，100% 3 min，95% 3 min，90% 3 min，85% 3 min，75% 3 min，蒸馏水3 min，蒸馏水3 min，PBS 3 min)；用苏木精染色1～3 min，自来水反蓝30～60 min，伊红复染1～5 min；染色后的切片用纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明；将已透明的切片滴上树胶，盖上盖玻片封固。显微镜观察蜕膜组织细胞形态。

2.3 免疫组化法检测各组蜕膜Foxp3、RORγt的表达

将石蜡切片以pH 6.0的枸橼酸液修复，加热、漂洗；3%H2O2孵育10 min。冲洗后滴加5%BSA，置于湿盒内30 min；先后加入一抗、二抗，并孵育，显色、复染、脱水、透明、封片后，镜下观察Foxp3及RORγt的表达。采用ImageProPlus 软件分析其平均光密度值。

2.4 WB法检测各组蜕膜Foxp3、RORγt的表达

提取组织蛋白，并用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。80V电压电泳使凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至PVDF膜上；然后65V转膜2 h。转好的膜对照marker进行裁剪，一抗4℃反应过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗(1×TBST 稀释300倍)作用60 min，化学发光成像系统对膜上的蛋白条带进行采集。

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 各组孕鼠蜕膜组织细胞形态的比较

光镜下可见对照组孕鼠蜕膜细胞形态规则、整齐，胞浆染色淡红，含量丰富，细胞核椭圆或类圆形；血管管壁完整，其内无明显瘀血附着。与对照组相比，模型组孕鼠蜕膜组织变性，蜕膜细胞数量减少，细胞排列杂乱无序，胞浆水肿，甚至空泡变，细胞核固缩，染色深重，同时血管数量减少。对照模型组，可见中、高剂量组及西药组孕鼠的蜕膜组织内细胞及血管数量均增加，胞质丰富，胞浆水肿减轻，核仁大而明显,详见图1(彩插1)。

3.2 免疫组化法中检测孕鼠蜕膜中Foxp3、RORγt表达

与对照组相比，模型组Foxp3表达下降，而RORγt的表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)。对比模型组，中药中、高剂量组和西药组Foxp3表达升高，RORγt表达下降，差异均有统计学意义(P<0.05)，低剂量组Foxp3、RORγt表达与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；西药组及中药中、高剂量组3组间Foxp3及RORγt的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。详见下页表1，图2及图3。

图2 免疫组化法中各组孕鼠蜕膜中Foxp3蛋白的表达

图3 免疫组化法中各组孕鼠蜕膜中RORγt蛋白的表达

表1 免疫组化法中各组孕鼠蜕膜中Foxp3、RORγt相对表达水平

3.3 WB法检测孕鼠蜕膜中Foxp3及RORγt表达

与对照组相比，模型组Foxp3表达下降，RORγt的表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，西药组及中药中、高剂量组3组孕鼠蜕膜组织中Foxp3的表达均升高，同时RORγt的表达均下降，差异有统计学意义(P<0.05)；而中药低剂量组孕鼠蜕膜组织中Foxp3及RORγt的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。西药组、中药中、高剂量组3组间Foxp3及RORγt的表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2，下页图4。

表2 Western Blot法中各组孕鼠蜕膜中Foxp3、RORγt相对表达水平

图4 Western Blot法中各组孕鼠蜕膜中Foxp3及RORγt的表达

4 讨论

RSA绝大多数发生在妊娠早期，随流产次数的增加其复发风险上升，是生殖疾病领域的难点问题，目前受到越来越多的重视及关注。近年来临床上可以明确的与RSA相关的病因包括父母双方或胚胎染色体异常、女性生殖道解剖结构异常、内分泌因素、免疫、感染以及血栓前状态等[3-4]，但仍有50%的人群病因不明[5]。妊娠时，母胎间的免疫耐受，可以使胎儿免于被母体免疫系统攻击其携带的来自父方的白细胞组织相容性抗原。既往认为，Th1/Th2细胞因子的平衡是维持生理性妊娠所必需的。近年来对于母胎界面免疫耐受，更具体到免疫反应如何调节，比如Th17/Treg细胞的免疫平衡作用。

Th17细胞是近年新发现的一种CD4+效应性T细胞亚群，可分泌IL-17A、IL-17F等细胞因子介导炎症反应，引发母胎界面的局部炎症反应[6]，继而发生流产。RORγt 特定表达于T细胞区域，在T淋巴细胞分化成熟中起着重要作用，是控制Th1型细胞中Th17的特异性转录因子[7-8]，能调节胸腺中T细胞的发育，以及外周血中效应性T细胞的分化，同时还能诱导Th17分泌细胞因子。有研究表明，RORγt在RSA患者外周血及蜕膜组织中，存在高表达现象。而敲除RORγt后可以抑制Th17细胞的表达。若同时敲除同一家族的RORα，甚至可以完全阻断Th17分化[9]。

近年来研究发现，Foxp3是建立和维持Treg细胞谱系的中心成员，Foxp3的高水平和稳定表达，是稳定Treg抑制功能的必须条件。当CD4+CD25+T淋巴细胞特异性地表达Foxp3后，Treg细胞就具备了其特性和功能，主要是抑制自身反应性T细胞的免疫反应，从而可以诱导机体对外来移植物的免疫耐受作用。Foxp3通过调控多种基因，起到调节Treg活性的作用[10],而CD4+CD25+Treg可以促进蜕膜组织免疫耐受，从而维持妊娠[11]。

本研究结果发现，自拟固胎煎中、高剂量组均可上调蜕膜中Foxp3表达，下调RORγt表达，并可改善蜕膜组织细胞环境，降低RSA小鼠的胚胎丢失率。这与课题组前期研究结果相吻合。这一结果提示，补肾健脾，益气养血安胎中药自拟固胎煎治疗RSA的作用机制，可能与其参与Th17/Treg免疫平衡调节，改善蜕膜环境作用相关。