黄芩苷调节PI3K/AKT通路对LPS诱导大鼠流产子宫巨噬细胞的影响

鲁小红

(咸宁市中心医院 产科，湖北 咸宁 437100)

流产发生率为1%～3%，给孕妇和家庭带来极大的痛苦。大量研究显示免疫细胞异常浸润与流产有关联[1]。巨噬细胞占植入部位所有蜕膜组织中白细胞的20%～25%[2]。巨噬细胞可能会极化为M1或者M2亚型，子宫蜕膜组织巨噬细胞在正常妊娠中会极化为M2亚型，而在妊娠并发症如子痫等中，子宫蜕膜组织巨噬细胞则极化为M1亚型，这会介导炎症反应并诱导滋养层细胞凋亡，进而诱发流产[3]。PI3K/AKT在调控巨噬细胞的活化和极化中具有关键作用，地塞米松通过激活PI3K/AKT通路抑制巨噬细胞向M1极化，从而抑制炎症反应缓解肺缺血/再灌注损伤[4]。黄芩苷为一种多酚类物质，是黄芩的主要活性单体。黄芩苷具有抗肿瘤、抗氧化应激、抗炎和调控免疫的作用。黄芩苷可通过促进巨噬细胞极化为M2表型改善实验性炎症性肠病[5],抑制滋养层细胞凋亡从而缓解子痫[6]，并且具有调控PI3K/AKT通路的作用[7]，但是其在流产中的作用和机制仍不清楚。本研究主要分析黄芩苷调节PI3K/AKT通路对流产动物模型巨噬细胞的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

SD大鼠(SPF级，雌性+雄性，210～240 g，北京维通利华动物公司)。脂多糖(lipopolysaccharid，LPS)和黄芩苷(Sigma公司，美国)，PI3K/AKT通路抑制剂LY294002(Selleck公司，美国)，ELISA试剂盒和TUNEL染色试剂盒(碧云天公司)，酶标仪(Model 680，Bio-Rad公司，美国)，免疫磁珠(Invitrogen公司，美国)，流式细胞仪以及巨噬细胞表型抗体试剂(Becton Dickinson公司，美国)，TRIzol(Sigma公司，美国)，PrimeScript-RT和SYBR Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa公司，日本)，RIPA裂解缓冲液(Beyotime公司)，BCA试剂盒(武汉博斯特生物技术有限公司)，抗体购自美国Abcam公司，PVDF膜(Bio-Rad公司，美国)。

1.2 大鼠的建模、分组和干预

将雌雄SD大鼠以2∶1的比例交配过夜，通过检查阴道精子的存在确认成功怀孕。将60只成功怀孕大鼠分为4组，即对照组、LPS组、LPS+黄芩苷组和LPS+黄芩苷+LY294002组(n=15)。在妊娠后第5天通过尾静脉注射LPS，剂量为1.0 μg·kg-1[8]；尾静脉注射黄芩苷[9]，剂量为5 mg·kg-1，每日1次，至妊娠第10天；腹腔注射LY294002(1 mg·kg-1)来抑制PI3K/AKT通路，每2天1次，至妊娠第10天。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 胚胎发育情况 在大鼠妊娠第10天进行安乐死，取出子宫组织，观察胚胎发育情况，计算流产率(流产胚胎数量/胚胎总数×100%)和胚胎吸收率(吸收胚胎数量/胚胎总数×100%)。其中出现1例胚胎吸收即将大鼠列为胚胎吸收。

1.3.2 ELISA检测炎症因子 取大鼠尾静脉血，以300 r·min-1离心15 min，收集上清液，根据试剂盒说明书加入抗体和显色剂，终止显色反应后15 min 内通过酶标仪检测450 nm处的吸光度，然后根据标准曲线计算肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的质量浓度。

1.3.3 流式细胞术检测巨噬细胞 利用免疫磁珠收集来自子宫组织的单核细胞，并使用染色缓冲液(BD Biosciences公司，美国)洗涤。分别使用藻蓝蛋白(APC)偶联的CD11c抗体和异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的F4/80抗体对细胞在避光下进行染色，染色温度为0℃，染色时间为30 min。使用FACS Calibur流式细胞仪进行检测，并使用FLOWJO软件分析巨噬细胞 比例(CD206和F4/80染色阳性的细胞为巨噬细胞)。

1.3.4 免疫组化检测巨噬细胞极化情况 通过免疫组化检测子宫蜕膜组织中M1巨噬细胞标志蛋白CD86和巨噬细胞标志蛋白CD206的表达水平。将大鼠巨噬细胞用4%的聚甲醛固定并用梯度醇脱水，包埋在石蜡中，制成厚度为5 μm的组织玻片标本，将切片在-20 ℃的冷丙酮中固定15 min。在37 ℃下 分别与抗大鼠CD86和CD206抗体孵育1 h，然后加入二抗进行显色，最后利用苏木精复染细胞核，棕色和黄色染色代表阳性细胞。随机选择5个高倍视野，计算M1细胞和M2细胞比例(CD86或CD206阳性细胞数目/总细胞数目×100%)。

1.3.5 RT-qPCR检测mRNA 按照“1.3.3”的方法利用免疫磁珠收集来自子宫组织的巨噬细胞，使用TRIzol获得总RNA，使用逆转录cDNA试剂盒逆转录1 μg RNA 用于合成cDNA(42℃下60 min，70 ℃下5 min，然后4 ℃保存)。 使用SYBR Green PCR Master Mix和PCR检测系统进行qPCR实验(95 ℃ 10 min;94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min， 60 ℃ 1 min，共40个循环;4 ℃ 保存)。使用GAPDH作为内参，通过比较循环阈值分析mRNA的水平表达。

1.3.6 Western blotting检测蛋白 将子宫中巨噬细胞研磨萃取总蛋白，通过BCA试剂盒测量浓度。取40 μg 的总蛋白使用10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳(PAGE，80～120 V，90 min)。在100 mV的恒定电压下与PVDF膜进行湿转移。在5%牛血清白蛋白(BSA)中于室温孵育1 h。将1∶500稀释的anti-PI3K、anti-p-PI3K、anti-AKT、anti-p-AKT添加到分离的蛋白质中，并在4 ℃下孵育过夜。洗涤后在室温下添加HRP标志的二抗孵育1 h。然后加入化学发光试剂进行显影。GAPDH用作内参。用Image J软件分析目标条带的灰度值。

1.4 统计学处理

使用SPSS 19.0软件进行统计分析。计数资料采用卡方检验；计量资料以均值±标准差表示，多组间比较进行单因素方差分析，两两比较使用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 黄芩苷对胚胎发育情况的影响

对照组大鼠仅有1例胚胎吸收。LPS组全部胚胎吸收和流产。LPS+黄芩苷组胚胎吸收6例，流产5例，均显著少于LPS组(均P<0.05)；LPS+黄芩苷+LY294002组胚胎吸收14例，流产13例，均显著多于LPS+黄芩苷组(均P<0.05)。见表1。

表1 黄芩苷对胚胎发育情况的影响 例

2.2 黄芩苷对LPS诱导流产模型大鼠炎症因子的影响

4组外周血炎症因子水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。LPS组TNF-α和IL-1β的水平显著高于对照组(均P<0.05)，LPS+黄芩苷组TNF-α和IL-1β的水平显著低于LPS组(均P<0.05)，LPS+黄芩苷+LY294002组TNF-α和IL-1β的水平显著高于LPS+黄芩苷组(均P<0.05)。见表2。

表2 黄芩苷对LPS诱导流产模型大鼠炎症因子的影响

2.3 黄芩苷对LPS诱导流产模型大鼠子宫巨噬细胞的影响

4组大鼠子宫巨噬细胞水平比较差异有统计学意义(F=28.712，P<0.001)。LPS组子宫巨噬细胞比例[(11.87±1.34)%]显著高于对照组[(3.91±0.87)%](P<0.05)，LPS+黄芩苷组子宫巨噬细胞比例[(6.83±1.04)%]显著低于LPS组(P<0.05), LPS+黄芩苷+LY294002组巨噬细胞比例[(9.92±1.74)%]显著高于LPS+黄芩苷组(P<0.05)。见图1。

图1 流式细胞术检测黄芩苷对LPS诱导流产模型大鼠子宫巨噬细胞的影响

2.4 黄芩苷对LPS诱导流产模型大鼠子宫蜕膜组织中巨噬细胞极化的影响

子宫蜕膜组织巨噬细胞中蓝色为被染色的细胞核，棕色为被染色的CD86蛋白，代表M1型巨噬细胞(图2)；蓝色为被染色的细胞核，棕色为被染色的CD206蛋白，代表M2型巨噬细胞(图3)。4组M1型和M2型细胞比例比较差异有统计学意义(均P<0.05)。LPS组M1型细胞比例显著高于对照组，而M2型细胞比例显著低于对照组(均P<0.05)；LPS+黄芩苷组M1型细胞比例显著低于对照组，而M2型细胞比例显著高于对照组(均P<0.05)；LPS+黄芩苷+LY294002组M1型细胞比例显著高于LPS+黄芩苷组，而M2型细胞比例显著低于LPS+黄芩苷组(P<0.05)。见表3。

图2 免疫组化检测黄芩苷对LPS诱导流产模型大鼠子宫蜕膜组织中巨噬细胞M1极化标志蛋白CD86的表达水平(×200)

图3 免疫组化检测黄芩苷对LPS诱导流产模型大鼠子宫蜕膜组织中巨噬细胞M2极化标志蛋白CD206的表达水平(×200)

表3 黄芩苷对LPS诱导流产模型大鼠子宫蜕膜组织中巨噬细胞极化的影响 %

2.5 黄芩苷对LPS诱导流产模型大鼠子宫巨噬细胞中PI3K、AKT mRNA表达水平的影响

4组子宫巨噬细胞PI3K、AKT mRNA表达水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)。LPS组PI3K、AKT mRNA表达水平显著低于对照组(均P<0.05)，LPS+黄芩苷组PI3K、AKT mRNA表达水平显著高于LPS组(均P<0.05)。见表4。

表4 黄芩苷对LPS诱导流产模型大鼠子宫巨噬细胞中PI3K、AKT mRNA表达水平的影响

2.6 黄芩苷对LPS诱导流产模型大鼠子宫巨噬细胞PI3K、AKT通路中蛋白表达水平的影响

4组子宫巨噬细胞PI3K/AKT通路中蛋白表达水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)。LPS组PI3K、AKT蛋白表达水平显著低于对照组(均P<0.05)，LPS+黄芩苷组PI3K、AKT蛋白表达水平显著高于LPS组(均P<0.05)，LPS+黄芩苷+LY294002组PI3K、AKT蛋白表达水平显著低于LPS+黄芩苷组(均P<0.05)。见图4和表5。

图4 Western blotting检测黄芩苷对LPS诱导流产模型大鼠子宫巨噬细胞中PI3K和AKT 蛋白表达水平

表5 黄芩苷对LPS诱导流产模型大鼠子宫巨噬细胞中PI3K、AKT蛋白表达水平的影响

3 讨 论

现阶段关于流产的具体机制仍不明确。遗传、子宫异常、内分泌和免疫功能障碍、感染、营养和环境因素、精神因素等均可能导致流产。对于母体来说，胎儿是半同种异体移植组织，怀孕期间免疫系统的调节对于维持母体对胎儿的免疫耐受和防止母体免疫系统攻击至关重要[10]。流产与炎症或免疫力之间的关联已得到广泛认可，但是目前对于流产尚无有效的干预手段。

黄芩作为一种常见的中草药，具有抗肿瘤、抗炎和调节免疫的作用，黄芩苷是其主要的活性成分[11-12]。马雁南等[9]报道，黄芩苷可以抑制子宫局部组织中TNF-α的表达，从而具有促进胚胎发育的作用。焦伟等[13]研究发现，黄芩苷可以缓解复发性流产小鼠的炎症反应。本研究使用LPS诱导大鼠流产模型，结果显示黄芩苷具有减少胚胎吸收、减少流产和抑制炎症反应的作用。此外，本研究结果还显示黄芩苷可以明显减少子宫中巨噬细胞的比例。子宫蜕膜组织中的巨噬细胞可发挥将适应性免疫系统和先天免疫系统联系起来的作用，从而调节微环境的免疫水平，保证妊娠的顺利进行[14]。妊娠期间子宫巨噬细胞数量的升高会影响子宫炎症微环境，是造成流产的因素之一。子宫蜕膜组织中巨噬细胞升高会导致胚胎发育不良[8]，而抑制巨噬细胞会缓解胚胎吸收和流产[15]。本研究结果提示，黄芩苷可能通过调节子宫中巨噬细胞来抑制炎症反应，从而抑制由LPS诱导的流产。

为进一步分析黄芩苷对巨噬细胞的影响和调控机制，通过免疫组化检测巨噬细胞M1极化标志蛋白CD86和M2极化标志蛋白CD206的水平，结果显示LPS会诱导蜕膜组织中M1型巨噬细胞的增多和M2型巨噬细胞的降低，而黄芩苷会抑制巨噬细胞M1型极化并诱导M2型极化。巨噬细胞向M1极化会分泌TNF-α和IL-1β等促炎因子，这会直接影响滋养层细胞并导致胚胎吸收[16]。PI3K/AKT通路的激活会引起AKT的磷酸化和核转位，进而诱导M2型极化，抑制PI3K/AKT通路会抑制M2型极化[17]。本研究结果还显示，LPS诱导流产模型大鼠巨噬细胞中PI3K、AKT转录和翻译水平降低，而黄芩苷会促进PI3K、AKT mRNA和蛋白的表达，使用PI3K/AKT通路抑制剂可以显著地阻断黄芩苷的缓解作用。文学平等[18]研究显示,黄芩苷具有抑制巨噬细胞向M1极化和抑制炎症细胞因子表达的作用。Xu等[19]研究发现,黄芩苷可通过抑制巨噬细胞向M1极化和诱导向M2极化缓解炎症反应，进而减少心肌细胞损伤。黄芩苷可通过激活PI3K/AKT通路诱导eNOS的表达，进而缓解心肌细胞缺血-再灌注损伤[20]。这提示LPS可能通过抑制PI3K/AKT诱导子宫巨噬细胞向M1极化导致流产，而黄芩苷可能通过提高PI3K/AKT转录和翻译的水平使巨噬细胞向M2型极化，从而缓解流产。

综上所述，黄芩苷可能通过促进PI3K/AKT通路来诱导子宫巨噬细胞向M2型极化和抑制向M1型极化，从而抑制流产，但是关于黄芩苷保护胚胎生长和调控巨噬细胞极化的机制仍须进一步研究。