利妥昔单抗对激素依赖型肾病综合征患儿T淋巴细胞亚群和尿CD80水平的影响

王汝琼，林道炯，吴守业，周琼花，陈金淑

(海南省妇女儿童医学中心 1.感染科， 2.肾病风湿免疫科，海南 海口 570000)

利妥昔单抗(rituximab，RTX)是一种针对CD20的嵌合型单克隆抗体[1]，用于治疗儿童肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)，其主要作用在于消耗 B细胞、抑制辅助性T细胞17亚型(Th17)分化和增加调节性T细胞(T regulatory，Treg)比例。多数患儿对RTX治疗敏感，但部分患儿会逐渐出现激素依赖综合征(steroid-dependent nephrotic syndrome，SDNS)或频繁复发[2]。NS的复发与Treg比例下调以及Th17/Treg之值失衡有关[3]。此外，共刺激分子CD80在微小病变患儿复发期时尿液中的含量明显升高，检测尿CD80水平有望成为早期诊断NS复发的生物学指标[3]。而抗原提呈细胞表达和分泌CD80则受到Treg分化的可溶性细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4和白细胞介素-10水平的影响。因此，NS患儿Treg比例下调以及Th17/Treg之值失衡可能是导致复发患儿尿CD80水平升高的重要原因。本研究旨在前瞻性地分析RTX对SDNS患儿T细胞亚群和尿CD80水平的影响，为寻找有效监测RTX免疫反应的生物学指标提供一定的帮助。

1 对象与方法

1.1 研究对象

采集2016年3月至2019年10月在本院儿科肾脏病科首次接受RTX治疗的28例SDNS患儿的外周血和尿液；患儿年龄≤18岁，排除了激素抵抗型NS患儿[连续口服30 d泼尼松(60 mg·m-2)和静脉注射3次强的松龙冲击治疗(1 g·1.73 m-2)后，仍持续表现为蛋白尿]。在糖皮质激素诱导缓解期进行1～2次RTX输注，每剂375 mg·m-2，间隔1周，分别于1个月、12个月(缓解患儿)或复发时(复发患儿)再次采集标本。RTX首次用药后，强的松龙每1～2周减少0.25 mg·kg-1，3～5个月后停药。在12个月的随访中，复发患儿每日接受强的松龙治疗直至缓解，然后连续4周隔日用药。随访期间，患儿没有接受其他任何免疫抑制药物治疗。每2个月用流式细胞术检测CD19表达缺失情况。当CD19+细胞少于1%淋巴细胞时，B淋巴细胞被认为完全耗尽。另外选择28例健康儿童作为对照组，明确诊断排除任何肾脏疾病、免疫系统疾病或急慢性感染，排除激素抵抗、肾功能受损[估计肾小球滤过率<60 ml·(min·1.73 m-2)-1]或在过去6个月内接受过环磷酰胺治疗的患儿。本研究获得本院伦理委员会的批准;采集患儿血样前都得到了家属和法定监护人的书面知情同意。

1.2 外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)分离和培养

采用密度梯度离心法从肝素化血液中分离PBMCs。用PBS将血液样本稀释，然后按2∶1的比例缓慢加入含有Ficoll的试管中，以1 500 r·min-1离心20 min(20 ℃)。收集细胞，洗涤后将2×106ml-1PBMCs接种于24孔培养板上，用含有10%胎牛血清、0.03%L-谷氨酰胺、0.36%HEPES缓冲液和1 μmol·L-1巯基乙醇的RPMI 1640培养液培养。用佛波酯(PMA，50 ng·ml-1)、离子霉素(500 ng·ml-1)和莫能菌素(2 μmol·L-1)刺激细胞，在37 ℃、体积分数5%的CO2和90% 湿度条件下培养4 h。胎牛血清购自美国Invitrogen公司，其他试剂购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.3 多色流式细胞术分析T、B细胞亚群

取EDTA处理的全血样本，分别用PE-CD19、APC-CD27、Percp-Cy-CD5、FITC-CD4、PE-Cy-CD8、APC-CD25、PE-Cy7-CD127、PE-Cy5-CD45、APC-Cy7-CD45抗体标记。样品在4 ℃黑暗中孵育30 min。使用1×FACS溶液裂解红细胞。加入2%多聚甲醛固定，用300 μl PBS缓冲液重悬细胞，用流式细胞术检测，对Th1、Th2、Th17和Treg进行免疫表型分析。淋巴细胞亚群的绝对计数是使用它们的频率和全血细胞计数计算出来的，全血细胞计数是在Beckman Coulter全血细胞计数分析仪上测定的。

1.4 尿CD80水平检测

对超滤浓缩尿样进行CD80定量分析。用PBS冲洗旋转柱后，以3 000 r·min-1离心30 min(20 ℃)。回收浓缩尿样品，保存在-80 ℃下，用ELISA试剂盒测定尿CD80水平。标准品及浓缩尿液样本检测一式两份。CD80的最终值以浓度因子为基础，以尿肌酐量进行归一化。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 两组儿童临床资料比较

两组儿童年龄、性别比例、血肌酐水平、血浆蛋白水平及血清白蛋白水平等差异均无统计学意义(P>0.05)。SDNS组尿蛋白/尿肌酐之值高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。SDNS组随访12个月，中位随访时间为193.5 d(134.3～258.5 d)。其中13例患儿复发，15例患儿缓解，复发率为46.43%。

2.2 两组T、B细胞亚群和尿CD80水平比较

与对照组相比，SDNS组治疗前外周血Th17、Th1、Th2和记忆B细胞绝对计数更高，Treg绝对计数减少，Th17/Treg之值升高，Th1/Th2之值降低，且尿CD80水平也明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组T、B细胞亚群细胞绝对计数和尿CD80水平基线值比较

2.3 RTX对SDNS患儿T、B细胞亚群和尿CD80水平的影响

随访过程中，13例患儿复发，15例患儿缓解。经重复测量的方差分析，各指标水平随时间不断波动变化，在各个时间存在水平差异。这种波动变化可能对复发存在一定影响：(1) 2个亚组患儿在不同检测时间点时各指标(除Th1绝对计数)比较差异均有统计学意义(P<0.05)。(2) 2个亚组之间各指标比较差异有统计学意义(P<0.05)。对于缓解亚组患儿，与基线值相比，RTX治疗后1个月和12个月时患儿Th17、Th1、Th2、记忆B细胞绝对计数减少，同时Treg绝对计数增加，Th17/Treg之值降低，Th1/Th2之值升高，尿CD80水平也降低(P<0.05)。对于复发亚组患儿，与基线值相比，RTX治疗后1个月和复发时Th2、记忆B细胞绝对计数减少，同时Treg绝对计数增加，Th17/Treg之值和尿CD80水平也降低(P<0.05)。另外，与缓解亚组治疗后1个月或随访12个月相比，复发亚组患儿治疗后1个月或复发时Th17、Th2、记忆B细胞绝对计数和尿CD80水平增加，Treg绝对计数减少，Th17/Treg之值升高，Th1/Th2之值降低，差异有统计学意义(P<0.05)。(3)复发亚组患儿Th17、Treg、Th1、Th2绝对计数、Th17/Treg之值以及尿CD80水平较缓解亚组波动范围小，差异有统计学意义(P<0.05)。记忆B细胞绝对计数在整个监测时间点和组间不存在交互作用(P>0.05)。见表3。

表3 RTX治疗对SDNS患儿外周血T、B细胞亚群细胞绝对计数和尿CD80水平的影响

3 讨 论

RTX是一种抗CD20的单克隆抗体，通过与CD20抗原结合，能立即破坏CD20+细胞[4]。注射RTX后患者的B细胞基本会损耗，大多数情况下会持续2～8个月。SDNS治疗指南[5]建议采用单一的RTX疗程，但是仍有部分患者会在注射RTX后12个月内复发，长期缓解率并不能令人满意。目前对于SDNS患儿使用RTX诱导缓解的机制缺乏了解，使得临床治疗基本上属于经验性治疗。本研究结果显示，RTX能够显著减少SDNS患儿外周循环中产生IL-17+Th17数量，增加Foxp3+Treg数量，使Th17/Treg之值逐渐降低，并促进Th1向Th2偏移，使Th1/Th2之值升高。RTX对Th17/Treg、Th1/Th2之值的影响与其他T细胞介导的疾病(包括风湿性关节炎和红斑性狼疮)的累积证据一致。

最近大量证据表明，免疫细胞数量失衡与SDNS的发病机制有关。Abdel-Hafez等[6]发现，SDNS患儿外周血IgE水平的升高以及IgG1、IgG2水平的降低与特异性反应有关，存在Th2细胞偏移。此外何婧等[7]也证实,NS复发还与Treg比例降低和Th17/Treg之值升高有关。产生IL-17的Th17和表达Foxp3的Treg之间的不平衡在NS的发病机制中起着重要作用[8]。本研究使用RTX治疗后1个月Th17/Treg之值降低，但是复发亚组患儿Th17/Treg之值降低程度低于缓解亚组，而且随后直至复发时，Th17/Treg之值不再继续降低，有部分患儿还会出现上升趋势。两剂量RTX治疗后IL-17+Th17数量减少，同时Treg数量增加，但Th17/Treg之值更高者疾病复发风险增加，其调节机制尚不清楚。

除此以外，Th1/Th2不平衡在SDNS中也起到一定的致病作用。Nickavar等[9]等证实，SDNS伴有特异性反应、Th2极化、细胞因子(包括IL-4、IL-6、IL-13)等循环水平明显升高，但是复发期间IFN-γ+Th1无变化。Stangou等[10]发现，NS患者血清中Th2相关因子(IL-10、IL-13)水平普遍上调，Th1相关因子(IL-2、IFN-γ)水平则普遍下调。这也支持了本研究结果，RTX治疗与IL-13+Th2数量明显下降有关，但是复发亚组患儿IL-13+Th2数量则一直处于较高水平，同时Th1/Th2之值显著低于缓解亚组患儿。

目前的研究结果表明，当RTX治疗后B细胞被耗尽时，它们的快速恢复预示着疾病的复发。这与既往的一些证据基本一致。Sato等[11]指出，B细胞的恢复与复发的风险增加有关。此外B细胞缺乏症患者复发NS的情况并不常见。最近Kim等[12]报道，B淋巴细胞及其细胞因子在蛋白尿发生中有重要的作用。体外实验也证实RTX与人HEK293T细胞上的鞘磷脂磷酸二酯酶样3b受体没有结合作用，说明RTX与其直接调节足细胞的能力无关。本研究复发亚组患儿记忆B细胞的数量高于缓解亚组患儿，这与之前报道的结果一致。而且对于缓解患儿，新恢复的记忆B细胞大部分是非致病性的，因为他们经历了中枢免疫耐受。RTX治疗可能通过消耗B细胞及相关细胞因子(如IL-6、TGF-β等)，进而影响Th17分化[13]。RTX也被认为通过结合与CD20具有相似结构的肥大细胞FcεRI，抑制肥大细胞依赖的Th17的扩增。B细胞通常会抑制Treg的分化，并放大效应T的功能。B 细胞活化因子促进Treg凋亡，以IL-2依赖的方式抑制其扩增。在B细胞缺乏的小鼠中，Treg的比例得到了提高和功能得到了增强[14]。RTX诱导的其他机制包括抑制B细胞和T细胞之间的CD40-CD40L共刺激相互作用，使Treg转化为炎症表型失败。

本研究复发亚组患儿尿CD80水平升高，这与Bhatia等[14]的研究结果一致。Treg通过CTLA-4和IL-10调节抗原提呈细胞CD80的表达。RTX治疗后Treg的增加可能是尿CD80排泄减少的原因。与这个假设一致，患儿在复发期间通常表现为循环CTLA-4和IL-10的减少，同时循环IL-13水平增加。RTX治疗后，外周血单个核细胞上细胞因子的表达变化可能与尿CD80水平降低有关。

综上，本研究结果表明，RTX诱导的记忆B细胞损耗对辅助性T细胞，主要是Th17/Treg之值和Th1/Th2之值有显著影响，且这种免疫失衡可能与复发有关；RTX治疗后尿CD80排泄减少。这些结果说明了免疫系统在SDNS发病机制中的重要性。但是，有必要进行进一步的研究以分析B淋巴细胞和T淋巴细胞之间确切的相互作用，以及B细胞来源的体液反应在疾病发病机制中的作用。此外，还须确定和验证SDNS使用RTX治疗后复发的危险因素。