万寿菊茎叶醇提物的镇痛抗炎活性研究

曾 益，李婧怡，周明康，曹栋才，娄琳琳，何 恒，何梦雪，邹俊杰，殷中琼

（四川农业大学动物医学院，成都 611130）

万寿菊（Tagetes erecta L.）为菊科万寿菊属一年生草本植物，又名臭芙蓉、里苦艾、万寿灯等，夏秋季采收，其茎粗壮直立，叶缘具腺体，释放异味，原产于墨西哥，因其抗性强、适应性广、花期长、花型丰富、花色纯正且品种众多，在我国被广泛栽培且应用范围较广，即可作为观赏花卉，又可作为药用植物和食品香料[1-2]。万寿菊作为一种经济作物，其花常被用于叶黄素的提取，但是茎叶部分未得到充分利用[3-4]。研究表明万寿菊茎叶中含有丰富的天然有效成分，主要包含黄酮、多糖、香豆素、皂苷、生物碱等[3，5]。黄酮类化合物具有多种药理活性，研究表明其具有抗氧化、抗心血管疾病，镇痛抗炎的作用[6-8]。回瑞华[9]等人使用超声波提取法分别制备了万寿菊花、茎、叶醇提物，发现万寿菊茎叶具有良好的抗氧化活性，且与黄酮类化合物的含量呈正相关。甚至有报道称，万寿菊茎叶中提取得到的黄酮类化合物具有体外抗肝癌和抗胃癌活性[10]。目前，有关万寿菊提取物的镇痛抗炎活性国内外均尚未有报道。本文前期利用正交试验得到了以黄酮类化合物的含量为判断标准的最佳万寿菊茎叶醇提物，再通过建立疼痛模型和炎症模型，初步研究其镇痛抗炎活性，希望为深入研究其活性物质和综合开发利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 受试动物

SPF级（20±2）g ICR小鼠，成都达硕生物科技有限公司。

1.2 药材及试剂

试验药材：新鲜万寿菊植株去除花和根，茎叶干燥后打成粉末。

试验试剂：ELISA IL-1试剂盒、ELISA IL-1β试剂盒、ELISA IL-6试剂盒、ELISA IL-8试剂盒、ELISA IL-10试剂盒、ELISA PGE2试剂盒、ELISA iNOS试剂盒、ELISA NO试剂盒，上海酶联生物科技有限公司；伊红染液、苏木素染液，南京建成生物研究所；脂多糖（LPS），北京索莱宝科技有限公司；穿心莲片，广州白云山和记黄埔中药有限公司；无水乙醇、多聚甲醛、蒸馏水。

1.3 仪器

中草药粉碎机；GZX-9070MBE型恒温鼓风干燥箱；RE-2000B旋转蒸发仪；FA2204A电子天平；SHZ-D型循环水真空泵；TGL-16G高速台式离心机；FA2204A电子天平；BIO-RAD酶标仪；YLS-6A智能热板仪；HS-120D超声波清洗机；ZS-B型三重纯水蒸馏器；移液器；各种玻璃试管；三角玻璃瓶等。

1.4 万寿菊茎叶醇提物的制备

将新鲜的万寿菊茎叶干燥后打成粉末，准确称取粉末500 g。采用超声波提取法制备醇提物，以70%乙醇为提取液，料液比为1∶30，超声温度为70℃、一共提取2次，每次提取1 h。经过抽滤、合并滤液，再将滤液减压浓缩后，放于50℃烘箱干燥至恒重，得万寿菊茎叶浸膏。

使用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法检测万寿菊茎叶醇提物的总黄酮含量[11]，具体步骤如下：

精密称取0.05 g提取物至50 mL容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密吸取1 mL至25 mL容量瓶中，加水至6.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加1.0 mol/L氢氧化钠溶液10.0 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min，采用紫外分光光度计在510 nm处测定吸光度值。绘制芦丁标准曲线，根据标准曲线回归方程和稀释倍数计算浸膏中的总黄酮含量。

1.5 万寿菊茎叶醇提物的镇痛试验研究[12-13]

1.5.1 醋酸扭体试验

取50只小鼠，分为空白对照组（0.5%CMC-Na），阳性对照组（穿心莲片250 mg/kg）以及万寿菊茎叶醇提物低、中、高剂量组（分别按总黄酮含量125、250、500 mg/kg给药），以上5组皆按0.2 mL/10 g连续灌胃7 d。各组小鼠末次灌胃1 h后，对每只小鼠腹腔注射0.7%的冰醋酸溶液0.1 mL/10 g，并观察记录小鼠注射后在5～20 min内发生扭体反应（伸展后肢、腹部内凹、臀部抬高）的次数。

1.5.2 电热板试验

将小鼠置于（55.5±0.5）℃恒温热板上，以舔后足为指标，筛选痛阈值大于5 s小于30 s的合格小鼠50只。对物理性致痛的影响热板法将痛阈值筛选合格的小鼠50只，将50只小鼠分成5组每组10只，分别为空白对照组（0.5%CMC-Na）、阳性对照组（穿心莲片250 mg/kg）以及万寿菊醇提物低、中、高剂量组（分别按总黄酮含量125、250、500 mg/kg给药），以上5组皆按0.2 mL/10 g灌胃7 d。按上述方式分组灌胃，末次灌胃30 min后，分别在30、60、90和120 min时测定各小鼠灌胃后的痛阈值。在测定中，如60 s内无痛反应，应立即取出，并以60 s计算。

镇痛百分率=[（给药组痛阈值-对照组痛阈值）/对照组痛阈值]×100%。

1.6 万寿菊茎叶醇提物的抗炎试验研究

1.6.1 小鼠的分组给药及炎症模型建立

取60只小鼠，随机分为空白对照组（0.5% CMC-Na）、模型组、阳性药物组（穿心莲片250 mg/kg）以及万寿菊茎叶醇提物低、中、高剂量组（分别按总黄酮含量125、250和500 mg/kg给药），药物组按0.2 mL/10 g连续灌胃7 d。末次给药30 min后，除空白组外其余小鼠腹腔注射LPS溶液140 μg/kg致炎，该剂量参照课题组王光熙等[14]构建大鼠炎症模型的LPS使用剂量，再依据小鼠和大鼠的体表面积等效换算而得[15]。观察各组小鼠的生长状况，并于致炎8 h后颈椎脱臼处死。

1.6.2 脏器指数

采样前称取各组小鼠的体重，经颈椎脱臼处死后立即对小鼠进行解剖。将采集好的心、肝、脾、肺和肾使用PBS清洗残留血液，吸干表面水分后立即于电子分析天平上称重。脏器指数=脏器重量（mg）/体重（g）。

1.6.3 组织病理学观察

取心、肝、脾、肺和肾修剪成合适大小，放入事先配置好的4%多聚甲醛溶液中固定48 h，随后开始石蜡切片的制作和HE染色。

1.6.4 血常规

小鼠眼球采血100 μL全血，置于含EDTA的采血管内并做好标记，于室温放置30 min后，将样品送至四川农业大学兽医院进行血常规检测。

1.6.5 血清炎性因子

用不含EDTA的采血管收集血液，于冰盒里放置适当时间，3 000 r/min离心10 min后收集血清。按照ELISA试剂盒说明书分别检测血清中炎性因子 IL-1、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、PGE2、iNOS 和NO的吸光度（OD值）。将标准品的OD值绘制标准曲线，根据曲线方程计算各待测因子在小鼠血清样品中的浓度。

1.7 数据处理

使用SPSS软件对数据进行处理，采用student’stest检验显著性分析，P＜0.05视为具有统计学差异，P＜0.01视为差异极显著，所有数据均以“平均值±标准差”（Mean±SD）来表示。

2 结果与分析

2.1 万寿菊茎叶醇提物的总黄酮含量

芦丁标准曲线如图1所示，其回归方程为y=10.656x，R2=0.999 3。经3次重复试验，万寿菊茎叶浸膏得率约为11.25%，浸膏中总黄酮含量约为13.29%。

图1 芦丁标准曲线图Figure 1 Standard curve of Rutin

2.2 万寿菊茎叶醇提物的镇痛试验研究

2.2.1 醋酸扭体试验

如表1所示，万寿菊茎叶醇提物各剂量组与空白对照组相比，能显著减少因腹腔注射冰醋酸引起的疼痛而产生扭体和舔足的次数（P＜0.01），从而证实万寿菊茎叶醇提物有明显的镇痛效果，且高剂量组优于中、低剂量组。

表1 万寿菊茎叶醇提物的醋酸扭体结果（X±S）Table 1 The acetic acid torsion results of alcohol extracts from Tagetes erecta L.stems and leaves（X±S）

2.2.2 电热板试验

由表2可知，与空白对照组相比，万寿菊茎叶醇提物高剂量组末次给药60 min后，能明显地提高小鼠的痛阈值，加强小鼠对热板的耐受力，小鼠镇痛率显著增大（P＜0.05），而万寿菊茎叶醇提物低中剂量组则无明显差异（P＞0.05）。由此可见，万寿菊茎叶醇提物高剂量组对热板法动物模型具有镇痛作用。

表2 万寿菊茎叶醇提物的电热板结果（X±S）Table 2 Electric heating plate results of alcohol extracts from Tagetes erecta L.stems and leaves（X±S）

2.3 万寿菊茎叶醇提物的抗炎试验研究

2.3.1 脏器指数

经LPS致炎后，小鼠脏器指数的结果如表3所示。与空白对照组相比较，模型组小鼠的肝、脾和肺脏器指数显著升高（P＜0.01）；穿心莲片组以及万寿菊茎叶醇提物低、中和高各剂量组小鼠的脾脏指数显著升高（P＜0.05），万寿菊茎叶醇提物高剂量组肺脏指数显著升高（P＜0.05），剩余各组剂的脏器指数均无明显差异（P＞0.05）。

表3 万寿菊茎叶醇提物对LPS致炎小鼠脏器指数的影响Table 3 Effect of alcohol extracts from Tagetes erecta L.stem and leaves on organ index of LPS-induced inflammatory mice

与模型组相比较，除了穿心莲片组小鼠的肝和肺、万寿菊茎叶醇提物低、中、高各剂量组小鼠的肝以及万寿菊茎叶醇提物低、中剂量组小鼠和的肺的脏器指数显著降低（P＜0.05）外，剩余各组小鼠的脏器指数则无明显差异（P＞0.05）。

与穿心莲片组相比较，除了万寿菊茎叶醇提物高剂量组小鼠的肺的脏器指数显著增大（P＜0.05）外，剩余各组小鼠脏器指数均无明显差异（P＞0.05）。

万寿具茎叶醇提物各剂量组小鼠的心、肝、脾和肾的脏器指数均无明显差异（P＞0.05）；万寿菊茎叶醇提物高剂量组小鼠的肺的脏器指数显著高于万寿菊茎叶醇提物低、中剂量组（P＜0.05）。

2.3.2 组织病理学观察

将各组小鼠心、肝、脾、肺和肾做组织病理学检测发现，各小鼠间心、肾确无明显病变，而肝、脾和肺组织有明显的病变情况，如图1～3所示。

图2 万寿菊醇提物对LPS致炎小鼠肝脏的影响Figure 2 Effect of Tagetes erecta L.alcohol extract on liver of LPS-induced inflammatory mice

图3 万寿菊醇提物对LPS致炎小鼠脾脏的影响Figure 3 Effect of Tagetes erecta L.alcohol extract on spleen of LPS-induced inflammatory mice

图2中，空白组肝脏具有正常结构，中央静脉周围肝索清晰可见；LPS组中央静脉周围肝细胞发生局灶性坏死，中性粒细胞浸润，肝血窦充血；穿心莲片组中央静脉周围肝细胞发生颗粒变性，肝血窦充血，但仍具有正常索状结构；万寿菊低剂量组中央静脉严重充血，部分肝细胞发生空泡变性；万寿菊中剂量组肝细胞发生轻微颗粒变性，肝血窦充血，但肝索结构清晰可见；万寿菊高剂量组肝细胞发生空泡变性，肝血窦充血，但具有正常肝索结构。

如图3所示，空白组脾脏具有正常结构；LPS组出现红髓脾窦扩张淤血，红髓白髓分界不清，可见多个朗汉斯巨细胞浸润；穿心莲片组和万寿菊醇提物低、中、高剂量组红髓脾窦同样扩张充血，但相较LPS组有所减弱。

如图4所示，空白组肺脏具有正常结构；模型组肺泡毛细血管壁增厚，局部出现溶血，并有炎性细胞浸润；而穿心莲片组和万寿菊醇提物低、中和高剂量组均未发现明显病变。

图4 万寿菊醇提物对LPS致炎小鼠肺脏的影响Figure 4 Effect of Tagetes erecta L.alcohol extract on lung of LPS-induced inflammatory mice

2.3.3 血常规

经LPS致炎后，小鼠血常规测定结果如表4所示。与空白对照组相比，模型组小鼠血液中的WBC、RBC、HGB、PLT 和 LYM 均有显著降低（P＜0.01），GRA 和MON也显著降低（P＜0.05）；万寿菊茎叶醇提物低、高剂量组小鼠血液中的RBC、HGB、PLT与空白对照组相比均显著降低（P＜0.01），LYM也显著降低（P＜0.05）；除此之外，高剂量组小鼠血液中的WBC和GRA与空白对照组相比也显著降低（P＜0.05）；万寿菊茎叶醇提物中剂量组小鼠血液中的RBC、PLT与空白对照组相比显著降低（P＜0.01），WBC也显著降低（P＜0.05）；穿心莲片组小鼠血液中除RBC和PLT与空白对照组相比显著降低（P＜0.01）外，剩余各指标均无明显差异（P＞0.05）。

表4 万寿菊茎叶醇提物对LPS致炎小鼠血液常规的影响n=6（x±s）Table 4 Effect of alcohol extracts from Tagetes erecta L.stems and leaves on blood routine of LPS-induced inflammatory mice n=6 （x±s）

与模型组相比，万寿菊茎叶醇提物低剂量组小鼠血液中WBC和HGB显著升高（P＜0.01）；中剂量组小鼠血液中的 WBC、RBC、HGB、PLT 显著升高（P＜0.01），GRA 和 MON 也显著升高（P＜0.05）；高剂量组小鼠血液中的HGB、WBC和PLT叶显著升高（P＜0.05）；穿心莲片组小鼠血液中 WBC、RBC、HGB、PLT显著升高（P＜0.01），LYM 和 MON 也显著升高（P＜0.05）。

与穿心莲片组相比，万寿菊茎叶醇提物各剂量组小鼠血液中的WBC、PLT、HGB、LYM、GRA 和MON均无明显差异（P＞0.05）；万寿菊茎叶醇提物除中剂量组外，其余各组的RBC与穿心莲片组相比显著降低（P＜0.05）。

所有组间的HCT、MCV、MPV和MCH均无显著差异（P＞0.05）。

2.3.4 血清炎性因子

经LPS致炎后，小鼠血清炎性因子检测结果如图5所示。与空白对照组相比，模型组、穿心莲片组以及万寿菊茎叶醇提物低、中、高剂量组小鼠血清中 IL-1、IL-1β、IL-6、IL-8、PGE2、iNOS 和 NO 的含量极显著上升（P＜0.01），穿心莲片组小鼠血清的IL-10含量显著下降（P＜0.05），而模型组和万寿菊茎叶醇提物低、中、高剂量组的IL-10含量极显著下降（P＜0.01）。

图5 万寿菊茎叶醇提物对LPS致炎小鼠血清炎性因子的影响Figure 5 Effect of alcohol extracts from Tagetes erecta L.stems and leaves on serum inflammatory factors in LPS-induced mice

与模型组相比，穿心莲片组的IL-1、IL-1β、IL-6、IL-8、PGE2、iNOS 和 NO 的含量显著下降（P＜0.05），其中 IL-1、IL-1β、IL-8、PGE2和 NO 差异极显著（P＜0.01），而 IL-10 的含量变化无统计学差异（P＞0.05）；万寿菊茎叶醇提物低剂量组小鼠血清中IL-1β和NO的含量显著下降（P＜0.05），其余炎性因子含量无统计学差异（P＞0.05）；万寿菊茎叶醇提物中剂量组小鼠血清中 IL-1、IL-1β、IL-6、IL-8、PGE2、iNOS 和NO的含量显著下降（P＜0.05），其中IL-1β和NO差异极显著（P＜0.01），而IL-10的含量的差异无统计学意义（P＞0.05）；万寿菊茎叶醇提物高剂量组小鼠血清中IL-1β、IL-8、PGE2和NO的含量显著下降（P＜0.05），尤以 IL-1β 和 NO 差异极显著（P＜0.01），其余炎性因子变化无统计学差异（P＞0.05）。

与穿心莲片组相比，万寿菊茎叶醇提物低剂量组小鼠血清中的IL-1和PGE2的含量显著上升（P＜0.05），其余炎性因子变化无统计学差异（P＞0.05）；万寿菊茎叶醇提物中剂量组小鼠血清中的所有炎性因子含量均无显著变化（P＞0.05）；万寿菊茎叶醇提物高剂量组小鼠血清中IL-1的含量极显著上升（P＜0.01），PGE2含量显著上升（P＜0.05），其余炎性因子变化无统计学差异（P＞0.05）。

万寿菊茎叶醇提物低、中、高剂量组间的IL-1、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、PGE2、iNOS 和 NO 均无显著差异（P＞0.05）。

3 讨论与结论

万寿菊是一种常见的经济作物，具有抗氧化、抗肿瘤、治疗心血管疾病等作用[5]。目前，关于万寿菊茎叶醇提物的镇痛抗炎作用还未见文献报道。在本试验中，给予不同剂量的万寿菊茎叶醇提物的小鼠在醋酸扭体试验中的扭体次数均显著低于空白对照组，表明该药有良好的外周镇痛作用；而在电热板试验中，给予不同剂量的万寿菊茎叶醇提物后，仅高剂量组小鼠的痛阈值和镇痛率显著提高，其余各组与空白对照组相比无明显差异，表明该药仅在高剂量下具有中枢镇痛作用。与其他菊科植物相比，万寿菊茎叶醇提物同样对化学性刺激引起的疼痛具有明显的镇痛作用，能够延缓疼痛的发生；对于物理性刺激引起的疼痛，则是在高剂量下且需较长代谢时间才发挥明显的镇痛作用[16-18]。黄酮类化合物具有显著的镇痛活性，因此我们推测万寿菊茎叶醇提物中起着镇痛作用的活性成分可能为黄酮类化合物[19-20]。

LPS可诱导全身性炎症产生，其作用于小鼠能够引起小鼠死亡、摄食改变、身体蜷缩弓背、活动减少以及体重和体温下降，对多种脏器均有损害作用[21-25]。本试验的研究发现，模型组小鼠在受到LPS的刺激后能引起体内炎症反应，导致大鼠心、肝、脾、肺和肾各脏器的脏器指数出现不同程度的增大，其中肝、肺的脏器指数最为明显，这一结果与王光熙等人的结果一致[14]。为了进一步确认机体组织器官或者细胞的病变情况，本试验通过石蜡切片HE染色对小鼠各脏器进行了观察。结果显示，经LPS诱导了小鼠全身炎症之后，各组小鼠心、肾无明显病变，肝、肺组织发生炎症反应，脾脏红髓脾窦充血。使用万寿菊茎叶醇提物预处理后，肝、肺组织的炎性病变明显减少，脾脏红髓脾窦充血有所缓解，说明万寿菊醇提物具有较好的抗炎作用。

综上所述，万寿菊具有良好的镇痛抗炎活性，其中高剂量的万寿菊醇提物具有最好的镇痛作用，而中剂量的万寿菊醇提物具有最好的抗炎活性。