高尿酸血症轻度认知功能障碍模型大鼠肠道菌群变化

穆卡然·艾买江，吴美薇，李 娜，何彭可，李佳川，邵晓妮

(西南民族大学药学院，四川 成都 610041)

高尿酸血症是一种临床常见的代谢性疾病，由嘌呤代谢紊乱或体内尿酸(uric acid, UA)排泄减少引起。研究表明，高尿酸血症除了引起痛风外，还与多系统疾病如肾脏、内分泌、心血管和脑血管疾病密切相关[1]。UA持续性升高对于多种神经退行性疾病的发生发展同样起到关键作用，是认知功能障碍的危险因素[2]。因此，阐明高尿酸血症轻度认知功能障碍的机制，对其防治具有重要意义。

高尿酸血症与认知功能障碍的关系近年受到高度关注。认知功能是广泛的脑功能，包括感知、思维、注意力、记忆等。它是客观反映脑功能的指标之一，也是生活质量评估的指标[3]。大量研究报道在临床与动物模型中，UA可参与刺激血管平滑肌增生、血管炎、血管内皮功能受损和氧化应激，并可直接促进动脉粥样硬化的形成，从而加速血栓形成，并引起各种心血管疾病[4]。认知功能障碍患者黑质密实区多巴胺能神经元的减少与线粒体功能障碍，氧自由基的毒性作用和氧化应激密切相关[4]。因此，可将血清尿酸(serum uric acid，SUA)水平作为轻度认知功能障碍患者疾病进展为痴呆的一个独立预测因素，但最终发展为轻度认知功能障碍的具体作用机制在很大程度上依然难以阐明。而近期有研究表明，长期高尿酸饮食会造成机体炎症水平增加，同时还对肠道菌群存在一定不良影响[5]。不同的饮食模式可以塑造不同特征的肠道菌群，高尿酸饮食所诱导的肠道菌群紊乱可能是引起轻度认知功能障碍发病机制的之一[6]。

肠道菌群可参与机体的营养吸收、生长发育、新陈代谢、免疫调节和衰老等活动，在维持机体健康中发挥着重要作用[7]。饮食是影响肠道菌群组成的重要因素，高果糖饮食、高脂肪饮食、高嘌呤饮食和高草酸盐饮食诱导的高尿酸血症模型中，肠道菌群的组成发生显著变化。黄胜南等[8]发现高嘌呤饮食可以引起鹌鹑肠道菌群的结构及其代谢产物发生显著变化。近年来，人们逐渐开始关注肠道菌群与神经退行性疾病的关系[9]。研究表明，肠道微生物能通过“微生物-肠-脑”轴影响大脑神经生化和行为表型，进而影响认知功能[10]。越来越多的药物作用机制研究中也将肠道菌群作为靶点进行深入探讨，但目前针对高尿酸血症轻度认知功能障碍的肠道菌群变化仍少有探究。

本研究通过对高尿酸血症轻度认知功能障碍模型大鼠进行相应的模型评价，并采用16S rDNA测序法研究模型大鼠的肠道菌群的变化,为阐释其分子机制及制定相关防治措施提供重要参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物选取Wistar ♂大鼠，SPF级。动物许可证号[SCXK(京)2016-0006]，体质量为(180-220)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养温度(20-24)℃、相对湿度45%-65%，12 h白天和12 h黑夜循环照明，自由饮食和饮水。正式实验开始前适应性喂养7 d。所有动物实验方案均经过西南民族大学动物伦理委员会审核批准，所有实验操作均严格按照实验动物伦理相关规定进行。

1.2 仪器EthosVision 7.0水迷宫视频跟踪分析系统(荷兰Noldus公司)；7020全自动血生化分析仪(日本Hitachi公司)；Biofuge 22R高速低温离心机(德国Heraeus sepatech)；PCR仪(ABI GeneAmp®9700型)；DYY 6C电泳仪(北京市六一仪器厂)；Illumina Miseq高通量测序仪(Illumina公司)。

1.3 药品与试剂UA、氧嗪酸钾(南京康满林化工实业有限公司)；SUA血生化试剂盒(四川迈克生物科技股份有限公司)；粪便基因组DNA提取试剂盒(116560-200, 美国MP Biomedical公司)。

1.4 实验方法

1.4.1模型的建立 Wistar大鼠适应性喂养7 d结束后，为消除动物个体之间差异，根据体质量将大鼠随机分为2组，每组8只。分别为空白对照组(control)和高尿酸血症模型组(hyperuricemia)。模型组大鼠饲喂含2%尿酸和2%氧嗪酸钾的高尿酸复合饲料，空白对照组大鼠饲喂生长维持饲料，连续饲喂12周。

1.4.2模型的评价 模型构建成功后，观察各组大鼠皮毛的色泽和自主活动行为。本研究参考相应文献，利用Morris水迷宫对大鼠学习记忆能力进行评估。训练阶段：将大鼠头朝池壁，随机将其放入水中，选择东、西、南和北四个象限之一。记录老鼠发现隐藏的水下平台的时间。训练后如果时间超过60 s，则将大鼠引导到平台上，让大鼠在平台上停留10 s，将其取出、擦干，然后放回笼中。每只大鼠每天训练4次，两次训练之间的间隔为30 min，需要连续训练 5 d[14]。测试阶段：训练后的d2，将平台移开，进行60 s的测试训练，并将测试大鼠从原始训练平台的象限的相反方向放入水中。记录在目标象限中，即最初放置平台的象限所需的时间，而逃逸潜伏期用作学习和记忆能力的指标。用视频跟踪分析系统记录大鼠的逃逸潜伏期。

1.4.3样本采集 Morris水迷宫试验后，禁食12 h，用10%水合氯醛麻醉大鼠，从腹主动脉取血，在室温下静置30 min，并在3 500 r·min-1下离心15 min。取血清，将其转移到EP管中。同时，收集大鼠粪便，将它们放在无菌的冷冻保存管中，并将其储存在液氮中，随后转置于-80 ℃冰箱保存，待测。

1.4.4粪便菌群基因组DNA提取与检测 从每组中取适量的大鼠粪便，并使用粪便基因组DNA提取试剂盒提取大鼠粪便cDNA。检测DNA浓度和纯度，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量并储存于-80 ℃用于PCR扩增。

1.4.5PCR扩增及高通量测序 粪便中微生物总DNA经琼脂糖凝胶电泳检验后合格即进行PCR扩增反应，对16S rDNA基因中的V3-V4区域片段进行PCR扩增。利用通用引物342F (5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)进行PCR扩增。扩增条件：98 ℃预变性 2 min；98 ℃变性15 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，25次循环；72 ℃再延伸 5 min。对于每个样本，分别加上7 bp的标签序列。扩增体系(25 μL)：5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，dNTP (2.5 mmol·L-1) 2 μL，引物：(10 μmol·L-1)各1 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5 DNA Polymerase 0.25 μL，10 ℃ 25-30循环。对目标条带进行扩增产物回收纯化、荧光定量，荧光定量染料为Quant-iTPicoGreen dsDNA Assay Kit。将纯化后的扩增子等量混合，采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库，检测合格后，使用Illumina MiSeq平台测序，所得原始数据经拼接、过滤得到目标序列。

1.4.6数据分析与处理 原始测序序列使用QiiME删除嵌合序列。随后，使用QiiME算法包中的Uclust对所有序列进行聚类，并选择代表性的OTU序列。基于Silva数据库(https://www.arb-silva.de/)对测序结果进行比较和分析，获得OTU的家族和属注释。将OTU结果分类后，对各个样本和分组在不同层次界(kingdom)、门(phylum)、 纲(class)、目(order)、科(family)、属(genus)、种(species)的菌种丰度进行展示。

1.4.7肠道菌群功能预测 使用PICRUSt标准化消除物种基因组中16S标记基因的拷贝数的影响；通过每个OTU对应的green gene id，获得COG(cluster of orthologous groups)家族信息和对应OTU信息的KEGG ortholog(KO)；并计算每个COG和KO的丰度。根据COG数据库中的信息，从eggNOG数据库中解析出每个COG的描述和功能信息，从而获得功能丰富度谱；根据KEGG数据库中的信息，可获得KO，pathway和EC信息，并根据OTU丰富度功能类别来计算每个信息。

2 结果

2.1 高尿酸血症大鼠模型的建立高尿酸复合饲料饲喂大鼠12周后，血生化指标测定结果显示高尿酸血症组SUA水平明显高于正常对照组[高尿酸血症组：(246.54±38.72) μmol·L-1，正常对照组：(74.62±13.24) μmol·L-1，且P<0.05]，表明高尿酸血症模型构建成功。

2.2 高尿酸血症大鼠产生轻度认知功能障碍Morris水迷宫适应期大鼠均毛发柔顺光亮，自主活动较多，造模结束后，随着测定天数的增加，两组大鼠寻找水下隐藏平台的逃逸潜伏期均缩短。与正常对照组相比，高尿酸血症组的大鼠的逃逸潜伏期相对较长(Fig 1A)，以及目标象限停留时间较短(Fig 1B)，表明高尿酸血症诱导大鼠产生轻度认知功能障碍。

Fig 1 Results of Morris water maze test n=7)

2.3 序列长度两组大鼠粪便中菌群序列均分布在400-500 bp内，与16S rDNA V3-V4区序列长度大致吻合，表明该样本可用于后续分析。

2.4 OTU划分和分类地位鉴定此研究中，RDP classifier用于对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，然后与Silva数据库进行比较，并在每个分类级别进行比较：界、门、纲、目、科、属、种统计各样本的群落组成。大鼠粪便样本共获得界：1个；门：15个；纲：28个；目：46个；科：93个；属：307个；种：133个。

2.5 肠道菌群16S rDNA基因测序深度评估Alpha多样性是指一个特定区域或者生态系统内的多样性[7]。Chao1值越大表明物种总数越多。Observedotus是统计了群落中特征OTU的数量，Observedotus值越大，表明物种总数越多。PD whole tree是用来描述系统发育多样性的指数，PD whole tree值越大，表明系统发育多样性越高。同样Shannon和Simpson值越大，表明群落多样性越高。大鼠粪便样品的所有稀释曲线(rarefaction curve)(Fig 2)。本研究中稀释曲线趋势平坦，表明测序数据合理，测样深度可靠。

Fig 2 Chao1, Observed, PD whole tree, Shannon and Simpson curves OTUs (operational taxonomic units) clustered at 97% sequence identity of all samples

2.6 肠道菌群多样性分析微生物多样性的研究可以通过单个样品的Alpha多样性分析或通过Beta多样性来反映微生物群落的丰富度和多样性。PCoA(principal co-ordinates analysis)主要用于研究数据可视化方法的相似性或差异性，可用于观察个人或群体之间的差异。对一系列特征值和特征向量进行排序后，选择前几个特征值作为距离矩阵中最重要的坐标。结果以数据矩阵的3D形式显示(Fig 3)。每个点代表一个样本。两点之间的距离越近，两者之间的社区组成差异就越小。

Fig 3 The principal co-ordinates analysis of all samples

2.7 肠道菌群差异菌属筛选及群落结构分析本研究中，LEfSe使用线性判别分析(LDA)来估计每种物种的丰度对差异效应的影响。LDA分析的主要目的是寻找在物种之间的丰度上具有显著差异的物种。与对照组相比，高尿酸血症轻度认知障碍大鼠粪便样本中的菌群和属水平分析如Fig 4所示。门水平上，粪便各组样本中主要的门分类水平有：厚壁菌门(Firmicutes)、软壁菌门(Tenericutes)和变形菌门(Proteobacteria)。厚壁菌门占据门水平中的主要比例，软壁菌门次之。属水平上，按所占比例依次为丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、厌氧原体属(Anaeroplasma)和丹毒丝菌属(Erysipelatoclostridium)等。对照组与模型组在属水平的构成上差异较大。

Fig 4 LEfSe hierarchical tree map of multistage species in faecesA: Cladogram; B: Biomarkers of different groups. Control group compared with hyperuricemia.

2.8 肠道菌群功能性预测采用PICRUSt(https://picrust.github.io/picrust/index.html)软件分析不同分组之间的功能差异。预测准确性在肠道微生物菌群的功能分析接近95%，能非常好得反映样品中的功能基因构成[8]。使用STAMP软件中two groups的Welch’st-test方法，过滤去除P>0.05的部分，Heatmap plot、PCA plot和Extented error bar图对不同样本间的物种丰度进行显著性差异两两检验。在粪便数据中发现多个相同功能预测结果(Fig 5)，其中氨基酸转运与代谢(amino acid transport and metabolism)代谢途径在两组样本中丰度较高，占主要地位，此外，二者还共同涉及糖转运与代谢(carbohydrate transport and metabolism)、细胞壁/膜/包体生物合成(cellwall/membrane/envelope biogenesis)、翻译及核糖体结构和生物合成 (translation, ribosomal structureand biogenesis)和转录(transcription)等代谢途径(Fig 6)。

Fig 5 Metabolic function prediction of community samplesA: COG (Cluster of orthologous groups) heatmap; B: COG PCA plot.

Fig 6 Metabolic function prediction of community samplesA: KO (KEGG Ontology) nocorrection; B: KO PCA plot.

3 讨论

随着近年来我国经济水平的高速发展，高尿酸血症的发病率逐年增加，已成为仅次于糖尿病的第二大代谢疾病。相关研究显示，UA可作为致炎、致氧化应激因子诱导认知功能障碍的发生，并可能最终导致一系列神经退行性疾病[3]。饮食是影响胃肠道微生物组成的重要因素，高糖、高脂、高嘌呤等所导致的高尿酸血症模型中肠道菌群组成均发生变化[11]。肠道与大脑之间存在的肠道菌群-肠-脑轴，肠道菌群可能通过此轴调控宿主的脑功能和行为活动等[12]。因此，本研究采用16S rDNA测序技术分析大鼠粪便中肠道菌群多样性，揭示高尿酸血症轻度认知功能障碍模型大鼠肠道菌群结构发生改变，并检测其学习与记忆功能。逃逸潜伏期和目标象限停留时间均为评价认知功能的重要指标。结果显示模型大鼠的逃逸潜伏期相对空白对照组较长，且目标象限停留时间较短，表明其高尿酸血症轻度认知功能障碍模型成功。

肠道菌群多样性检测结果表明，与对照组相比，模型大鼠粪便样本中的菌群从门水平到属水平均发生了显著变化；粪便样本肠道菌群虽构成相似，但不同门、属之间的组成比例差异较大。粪便样本中，厚壁菌门占据门水平中主要比例，软壁菌门次之，其余还包括变形菌门；属水平上，按所占比例依次为丁酸弧菌属、瘤胃菌属、厌氧原体属、丹毒丝菌属、丁酸球菌属、Lachnoclostridium属、Tyzzerella属、副萨特氏菌属和多尔氏菌属等。其中，丁酸弧菌属、丹毒丝菌属、厌氧原体属、Lachnoclostridium属和多尔氏菌属在高尿酸血症大鼠粪便中丰度显著升高，而瘤胃菌属、丁酸球菌属、Tyzzerella属和副萨特氏菌属丰度显著降低。

在大鼠和人体内，厚壁菌门是肠道菌群门分类水平的主要组成部分。已有研究表明，肥胖、2型糖尿病和高尿酸血症是导致认知衰退最常见的风险因素，高脂和高尿酸饮食被证明可以加速认知退化，且与厚壁菌门的比例相关，比例越高，症状越明显[13]；亦有研究发现，其比值的升高与体内葡萄糖水平的恶化、脂肪积累的加重和体重的升高相关[14]。本实验粪便样本中，与空白组相比，模型组厚壁菌门丰度上升，如Butyrivibrio菌属、Erysipelatoclostridium菌属、Lachnoclostridium5菌属和Dorea菌属其比值呈上升趋势。此结果与Sanguinetti等[14]的研究结果相符，表明Dorea菌属与认知功能存在负相关关系。厚壁菌门还可参与调节免疫，从而进一步调节脂质、葡萄糖代谢和代谢综合征。亦有研究表明高尿酸饮食导致脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)水平增加，产生内毒素血症[15]。后者导致慢性低水平炎症和氧化应激反应，这些都是代谢综合征的特点。此外，LPS通过TLR信号通路直接维持炎症，尤其是TLR4充当白细胞分化抗原CD14受体，介导LPS引起炎症级联和先天免疫反应[15]。上述改变均可导致中枢神经系统的慢性亚临床炎症以及氧化应激反应，最终可能导致出现认知及脑功能改变。

短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)是肠道微生物分解低聚糖、多糖、肽、蛋白质和糖蛋白产生的代谢产物，包括丁酸盐、乙酸盐及丙酸酯，不仅可以保持肠道的酸性环境，抑制肠道内有害菌的生长，还可以与GPR43受体结合刺激L细胞从而调节能量利用，与高尿酸血症具有一定相关性[16]。研究表明，单钠尿酸晶体(monosodium urate，MSU)可诱导白细胞趋化，进一步产生炎症介质，从而导致痛风急性发作的炎症反应。研究显示，SCFAs在调节机体对MSU晶体导致的炎症反应中发挥着重要作用[17]。另一项研究也表明，高尿酸血症的发生机制与肠道菌群代谢产物LPS激活黄嘌呤氧化酶活性可能存在相关性。上述发现可以解释本实验中模型大鼠的粪便中与主要代谢物为丁酸盐的丁酸弧菌属(Butyrivibrio)含量显著升高的现象。

此外，本研究还在模型大鼠的粪便中发现变形菌门中副萨特氏菌属(Parasutterella)含量显著降低。前期研究已报道，副萨特氏菌属(Parasutterella)能够产生琥珀酸，可促进严格厌氧细菌的生长与繁殖，对宿主产生有益作用，且琥珀酸对机体有抗炎和抗氧化作用[18]。推测长期高尿酸饮食可能影响琥珀酸的生产，进而诱发轻度认知功能障碍。

越来越多的证据表明，肠道菌群失调涉及认知障碍过程，重新平衡肠道菌群可以缓解认知障碍和神经精神症状[11]。脑-肠轴通过肠道菌群及其代谢产物调节认知功能。大脑和肠道通过重叠和互补的信号通路，包括植物神经系统、神经内分泌和免疫系统，以及细菌代谢产物和神经调节分子完成互动对话[7]。来自中枢神经系统的许多神经纤维通过迷走神经终止于肠粘膜，并与脊髓的交感神经一起形成肠神经系统，从而调节肠的功能。同时，也可以使用来自肠的肠刺激。迷走神经的传入纤维被上传到中枢神经系统，以完成与大脑的信息交换。

综上所述，以高尿酸血症轻度认知功能障碍大鼠为实验模型，采用16S rDNA测序技术分析大鼠粪便样本中肠道菌群多样性，研究长期高尿酸饮食对大鼠肠道菌群多样性的干预作用，以期从肠道微环境的角度揭示高尿酸血症诱发轻度认知功能障碍的作用机制，并为临床开展合理防治措施提供参考依据。