一株香蕉枯萎病拮抗菌的筛选、鉴定及生防效果研究

李枢妍 阳黎恒 肖雪婷 胡锦欢 张红岩 申乃坤 姜明国

摘要：【目的】篩选获得对香蕉枯萎病病原菌具有拮抗作用的菌株，为香蕉枯萎病生物防治提供菌株资源。【方法】以香蕉根际土壤为材料，利用铬天青（Chromeazurol S，CAS）双层平板法和平板对峙法筛选可分泌铁载体且对香蕉枯萎病菌具有拮抗作用的菌株;通过平板对峙法测定拮抗菌株对6种常见植物病原菌的拮抗活性;通过形态学观察、生理生化测定和16S rDNA序列分析明确拮抗菌株的分类地位;通过盆栽试验验证拮抗菌株对香蕉枯萎病的防治效果及对香蕉植株的促生作用。【结果】经CAS培养基初筛，从土壤中分离获得60株可分泌铁载体的菌株，平板对峙法复筛得到5株拮抗作用较强的菌株，其中菌株Gxun-2的抑菌效果最强，平均抑菌率达74.45%，且对供试的其他6种植物病原菌均具有较好的抑制效果，具有广谱抗菌性。结合菌落形态、生理生化及16S rDNA进化树分析结果，菌株Gxun-2鉴定为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。盆栽试验显示，菌株Gxun-2对香蕉枯萎病具有较好的防病作用，防治效果达84.21%，且对香蕉植株具有一定的促生效果，香蕉苗鲜重较对照增加32.96%。【结论】菌株Gxun-2对香蕉枯萎病具有较好的防治作用，且对香蕉植株具有一定的促生效果，可作为研制香蕉枯萎病生防菌剂的候选菌株资源。

关键词： 香蕉枯萎病;铁载体;拮抗菌;分离鉴定;抑菌效果

中图分类号： S436.681;Q939.95                  文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）07-1826-09

Screening， identification and biocontrol effect of antagonistic bacteria against banana Fusarium wilt

LI Shu-yan1， YANG Li-heng1， XIAO Xue-ting1， HU Jin-huan1，

ZHANG Hong-yan2， SHEN Nai-kun1*， JIANG Ming-guo1， 2

（1College of Oceanography and Biotechnology，Guangxi University for Nationalities/Guangxi Key Laboratory of Polysaccharide Materials and Modification/Guangxi Key Laboratory of Efficient Microbial and Plant Resources Utilization， Nanning  530000， China; 2School of Chemistry and Chemical Engineering， Guangxi University for Nationalities/Guangxi Key Laboratory of Forest Products Chemistry and Engineering， Nanning  530000， China）

Abstract：【Objective】The aim was to screen and obtain antagonistic strains against banana Fusarium wilt， and provide strain resources for biological control of banana Fusarium wilt. 【Method】The banana rhizosphere soil was used as the material to screen the strains that could secrete siderophores and had antagonistic effect on Fusarium oxysporum f sp. cubense by using chromeazurol S （CAS） double-layer plate and plate confrontation method. The antagonistic activity of antagonistic strains against six common plant pathogenic bacteria was determined by plate confrontation method. The taxonomic status of the antagonistic strains was clarified through physiological and biochemical determination and 16S rDNA sequence analysis. The pot experiment was conducted to verify the efficacy of the antagonistic strains against banana Fusarium wilt and their growth-promoting effects on banana plants. 【Result】After initially screened with CAS medium， 60 strains secreting siderophores were screened out from the soil， and five strains were selected out of them by plate confrontation method. Among them， Gxun-2 had the highest bacteriostatic rate， reaching 74.45%， and had fine inhibitory effect on the other six plant pathogens tested， with broad-spectrum antibacterial property. Combined with colony morphology， physiology and biochemistry and 16S rDNA phylogenetic tree analysis， Gxun-2 was identified as Pseudomonas aeruginosa. Pot experiment showed that the strain had obvious disease prevention effect on banana  Fusarium wilt with the control effect reaching 84.21%. It had certain growth promoting effect on banana plants，  the fresh seedling weight increased by 32.96%. 【Conclusion】Gxun-2 strain has a strong effect on preventing and treating banana wilt， and promoting growth of banana seedlings， and can be used as a candidate strain resource for development of candidate strain resources for biological control of banana Fusarium wilt.

Key words： banana Fusarium wilt; siderophores; antagonistic bacteria; isolation and identification; bacteriostatic effect

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31660022）; National Undergraduate Innovation and Entrepreneurship Training Program（202010608012）; Guangxi Science and Technology Key Research and Development Project（AA18242026）; Xiangsihu Young Scholars Innovation Team Project of Guangxi University for Nationalities（2017-6）

0 引言

【研究意义】香蕉是世界上贸易量最大的水果之一，也是许多国家的主粮作物，具有十分重要的地位。病虫害是香蕉产业化生产的制约因素之一，其中香蕉枯萎病对香蕉的危害最为严重。香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，FOC）引起的真菌土传病害，其发生范围广泛，易于流行且难以防治（庄令，2017;Wang et al.，2018;马凤娟等，2019）。香蕉枯萎病病原菌侵染香蕉植株后，会使维管束组织堵塞，严重时植株直接死亡，造成香蕉大量减产，甚至绝产。目前，香蕉枯萎病在我国云南、广西和福建等香蕉主产区大面积发生（苏琴等，2019），给我国香蕉种植业造成毁灭性打击，与水稻轮作是当前防治该病害的最有效途径，但需要较长的种植周期才能发挥效果（杨迪等，2021）。生物防治具有安全、绿色、高效等优点，筛选更多效果好、易培养的拮抗菌则是香蕉枯萎病生物防治的基础工作，对香蕉产业的可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】前人研究表明，可分泌铁载体的细菌通过与植物病原菌竞争铁离子（Gamalero and Glick，2011），同时分泌吩嗪、表面活性剂和羊毛硫抗生素等活性物质（Rungin et al.，2012），从而抑制病原菌生长;此外，分泌铁载体的菌株往往还可促进植物生长。Derbyshire等（2019）研究了40株PGPR菌株，发现这些菌株既能分泌铁载体，又能显著抑制致病的尖孢镰刀菌和番茄青枯病菌菌丝生长;Ghazy和El-Nahrawy（2020）利用CAS双层平板法筛选出2株高产铁载体的菌株，并证明其能有效抑制玉米晚枯病菌菌丝生长和促进玉米植株生长。针对香蕉枯萎病拮抗菌也有较多研究。黄建凤等（2017）从发生香蕉枯萎病蕉园健康植株根际筛选出2株拮抗菌，鉴定为枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，生防效率分别为59.1%和53.0%;徐志周等（2019）筛选出1株拮抗菌鉴定为伯克霍尔德菌，并通过正交试验进行发酵条件优化，极大提高了其对尖孢镰刀菌的抑菌率;叶乃玮等（2019）通过平板对峙法筛选出3株对香蕉枯萎病菌有拮抗效果的木霉菌，并通过温室和大田药效试验检测组合菌株的防效，结果表明，组合木霉菌对香蕉枯萎病的防治效果显著高于对照组，并对香蕉单穗重有一定的提升效果;赖宝春等（2020）利用平板对峙及盆栽试验等方法，发现灰锈赤链霉菌可对香蕉枯萎病产生良好的生防效果，且具有促生作用;周维等（2020）通过平板对峙法、生长速率法、平板对扣法及杯苗灌根接种法，发现菌株G9R-3能提高盆栽抗、感病香蕉品种的防治效果;杨迪等（2021）在香蕉根际土壤中筛选出2株对香蕉枯萎病具有良好防治效果的细菌，经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。【本研究切入点】生物防治具有研发周期相对短及环境友好等优点，是目前香蕉枯萎病防治的研究热点之一。而筛选更多效果好、易培養的拮抗菌是香蕉枯病生物防治的基础工作，但目前筛选香蕉枯病拮抗菌的方法单一，效率较低。【拟解决的关键问题】以健康香蕉根际土壤为分离来源，利用铬天青（Chromeazurol S，CAS）双层平板分离可分泌铁载体的菌株，再利用平板对峙法对分离菌株的拮抗效果进行复筛，筛选出抑菌率最高的菌株，进而对高抑菌率菌株进行分类鉴定、抑菌谱测定及香蕉枯萎病盆栽防效试验，从而确定高抑菌率菌株的分类地位及对香蕉枯萎病的生防效果，旨在为高抑菌率菌株的进一步田间开发应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试生防菌株从广西金穗集团农场健康香蕉根际土壤中分离纯化获得。供试病原菌为香蕉枯萎病菌尖孢镰刀菌4号生理小种（F. oxysporum f. sp. cubense race 4，Foc4），其他供试植物病原真菌有香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、小麦平脐蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana）、假禾谷镰刀菌（F. pseudo graminearum）、烟草赤星菌（Alternaria alternata）、烟草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）和萝卜黑心病原菌（Plectosphaerella cucumerina），均由广西农业科学院植物保护研究所提供。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 拮抗菌的分离筛选与拮抗能力评估 分泌铁载体细菌筛选：采用CAS双层平板筛选分泌铁载体细菌。将采集的健康香蕉根际土壤分别稀释10-1、10-2和10-3等3个梯度悬液，每个浓度吸取100 μL分别涂布在PDA、LB和NA培养基上分离单菌落，将分离得到的菌株点样至CAS检测平板（朱芝宜等，2020），35 ℃下培养24～48 h，根据平板上颜色的变化（由蓝到橙）及光圈直径大小，筛选出分泌铁载体较强的菌株。

香蕉枯萎病拮抗菌筛选：采用平板对峙法筛选香蕉枯萎病拮抗菌。以香蕉枯萎病菌尖孢镰刀菌4号生理小种（以下简称尖孢镰刀菌）为靶标菌，对分离到的可分泌铁载体菌株进行拮抗活性筛选。先将尖孢镰刀菌接种到PDA培养基上30 ℃下培养7 d，然后用灭菌打孔器打成5 mm的圆形菌饼，再接种到PDA培养基中央，在距离中央2.5 cm处点接筛选出的可分泌铁载体菌株菌液，每个培养基对称选取4个点，以只接尖孢镰刀菌的PDA培养基为对照，每组3个重复，28 ℃恒温培养7 d。观察可分泌铁载体菌株对尖孢镰刀菌的抑制效果，待对照菌落长满整个培养皿时，采用十字交叉法测量抑菌圈直径，计算抑菌率。抑菌率（%）=（对照组靶标菌菌落平均直径-试验组靶标菌菌落平均直径）/对照组靶标菌菌落平均直径×100（桑建伟，2018）。

拮抗菌株抑菌谱测定：测定拮抗菌株对其他6株供试植物病原菌的拮抗活性，方法同香蕉枯萎病拮抗菌筛选。

拮抗菌株对病原菌菌丝生长及形态的影响：分别挑取与拮抗菌株对峙平板上的病原菌菌丝与对照组病原菌菌丝于洁净载玻片上制片，在光学显微镜下观察并记录菌丝生长及形态。

1. 2. 2 拮抗菌株分类鉴定

1. 2. 2. 1 形态学观察 将拮抗菌株在LB培养基上划线28 ℃下培养24 h，观察记录菌落形态、颜色及透明度等特征，并在光学显微镜下观察细菌形态。

1. 2. 2. 2 生理生化特征 拮抗菌株的生理生化反应测定参照《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001）和《伯杰细菌鉴定手册》（布坎南和吉本斯，1984）。

1. 2. 2. 3 拮抗菌株种属鉴定 将拮抗菌株接种到LB液体培养基中，30 ℃下200 r/min振荡培养24 h，取1 mL菌液12000 r/min离心1 min收集菌体，采用Chelex-100提取拮抗菌DNA。使用通用引物Eubac27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和Eubac1492R（5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'）作为细菌16S rDNA扩增上、下游引物（周登博等，2017）。PCR反应体系50 μL：上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，2×Taq PCR Mix 25 μL，ddH2O 21 μL;扩增程序：95 ℃预变性4 min;95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，进行32个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序结果在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行序列比对，运用MEGA 6.0的Neighbor-joining法（自展数为1000）构建并分析菌株系统发育进化树（杨迪等，2021）。

1. 2. 3 拮抗菌株对香蕉枯萎病盆栽防效及对香蕉植株的促生作用测定

1. 2. 3. 1 拮抗菌株发酵原液制备 挑取LB固体培养基上拮抗菌株单菌落到LB液体培养基中35 ℃过夜培养作为种子液，按2%的接种量转接到新鲜的LB液体培养基中，200 r/min下35 ℃培养2 d，稀释至OD600=1.0，用血球计数板调节菌悬液浓度为1.0×108 CFU/mL。

1. 2. 3. 2 尖孢镰刀菌孢子液制备 刮取PDA固体培养基上培养的病原菌菌丝至PDB液体培养基中，28 ℃下200 r/min培养5 d，用2层纱布过滤去除菌丝，用血球计数板调节孢子浓度至1×106 CFU/mL，4 ℃下储存待用。

1. 2. 3. 3 试验设计 将3～4片叶龄的香蕉苗移栽至以灭菌土与蛭石为基质的花盆中，10 d后选取长势基本一致的香蕉苗，每盆香蕉苗伤根处理后灌根接种25 mL处理液。阳性对照组1（FOC）：尖孢镰刀菌孢子悬液;阴性对照组2（CK）：LB液体培养基;处理组1（FOC+拮抗菌）：尖孢镰刀菌孢子悬液+拮抗菌株发酵原液;处理组2（拮抗菌）：拮抗菌发酵原液。7 d后再次向处理组1和处理2灌根等量的拮抗菌发酵原液。所有处理3次重复。

1. 2. 3. 4 测定项目及方法 接种30 d后，观察记录香蕉苗发病情况。根据香蕉苗球茎纵剖面褐变程度确定病级：0级，球茎纵剖面无褐变出现;1级，球茎纵剖面褐变面积≤25%;3级，25%<球茎纵剖面褐变面积≤50%;5级，50%<球茎纵剖面褐变面积≤75%;7级，球茎纵剖面褐变面积>75%（杜婵娟等，2020）;计算各组病情指数和防效，发病指数（%）=∑（各级病株数×相对级数值）/（调查总株数×最高病级数值）×100，防治效果（%）=（CK病情指数-处理病情指数）/ CK病情指数×100。测量各组香蕉苗鲜重，计算拮抗菌株促生效率，促生效率（%）=∑（处理组2各株鲜重-阴性对照组2各株鲜重）/阴性对照组2各株鲜重×100。

2 结果与分析

2. 1 分泌鐵载体细菌分离结果

经CAS培养基初筛，从土壤中初步筛选得到284株菌株，其中60株可在菌落周围出现橙色晕圈，为可分泌铁载体菌株（图1）。再经平板对峙法复筛得到5株对尖孢镰刀菌具有较强拮抗效果的菌株（表1，图2），其中Gxun-2的抑菌效果最强，病原菌菌落平均直径仅为1.95 cm，平均抑菌率达74.45%，故将Gxun-2作为后续研究目标菌株。

2. 2 菌株Gxun-2的抑菌谱测定结果

由表2可看出，菌株Gxun-2对供试植物病原菌均有一定的抑制效果，其中对小麦平脐蠕孢菌的平均抑菌率最高，为80.96%，显著高于对其他病原菌的抑菌率（P<0.05）;对香蕉炭疽病菌、假禾谷镰刀菌、烟草靶斑病菌和萝卜黑心病原菌的平均抑菌率在70.00%～80.00%，对烟草赤星菌的平均抑菌率为64.85%，表明菌株Gxun-2对尖孢镰刀菌以外的其他常见植物病原真菌也有较好的抑制效果，具有广谱抑制作用。

2. 3 菌株Gxun-2对病原菌菌丝生长及形态的影响

光学显微镜下观察发现，未处理病原菌菌丝光滑，粗细均匀，生长健壮;而经菌株Gxun-2拮抗的病原菌菌丝多发生畸变，颜色变暗、变粗，许多菌丝出现断裂或弯曲打结现象（图3）。

2. 4 拮抗菌株Gxun-2鉴定

2. 4. 1 菌株形态学及生理生化特征 菌株Gxun-2在LB培养基上生长状况良好，菌落呈圆形，表面光滑，边缘较整齐，能分泌黄绿色色素散发荧光（图4-A）。革兰氏染色结果为阴性菌，菌体形态呈短杆状（图4-B）。生理生化鉴定结果（表3）显示，菌株Gxun-2在NaCl 含量5.5%以下均可生长，明胶液化、卵磷脂酶、硝酸盐还原、氧化酶试验、精氨酸双水解及葡萄糖利用接触酶反应为阳性;V-P试验、木糖利用、MR试验及硫化氢产生为阴性。

2. 4. 2 菌株Gxun-2 16S rDNA序列测定分析与系统发育进化树构建 以菌株Gxun-2基因组为模板，经16S rDNA PCR扩增，其产物测序后得到1438 bp的基因片段。将该扩增序列通过EzBioCloud进行相似性比对，选取15株与Gxun-2同源性较高的菌株序列通过MEGA 6.0构建系统发育进化树。结果（图5）显示，菌株Gxun-2与铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）JCM 5962处于同一分支，最大相似度为100%。结合菌株形态学特征和生理生化检测，将菌株Gxun-2鉴定为铜绿假单胞菌。

2. 5 菌株Gxun-2对香蕉枯萎病盆栽防效及对香蕉植株的促生效果

盆栽防效及促生效果试验结果（图6和图7）显示，阳性对照组1（FOC）香蕉苗球茎纵剖面褐变明显（图6-A），发病率达90.48%，而经菌株Gxun-2处理后处理组1（FOC+Gxun-2）香蕉苗的发病率为14.29%，防治效果达84.21%;且菌株Gxun-2处理组（Gxun-2）鲜重较对照组2（CK）提高32.96%，说明该菌株对香蕉苗具有较高的防病和促生效果。

3 讨论

香蕉枯萎病是一种危害严重的真菌土传病害，目前尚无有效的防治方法。生物防治具有安全、有效、持久等优点，成为近年来的研究热点之一。国内有关利用生防微生物防控香蕉枯萎病的研究已有较多报道，筛选出包括芽孢杆菌（马凤娟等，2019;邓涛等，2020）、放线菌（赖宝春等，2020）和木霉（朱佳芯等，2021）等多种对香蕉枯萎病具有良好拮抗效果的微生物。但在拮抗菌株筛选、菌株拮抗效果及拮抗机理方面仍有待进一步研究。本研究从健康香蕉根际土壤利用CAS平板初筛获得60株可分泌铁载体的菌株，再经过平板对峙复筛获得5株菌株的抑菌率在30.00%以上，其中编号为 Gxun-2菌株的抑菌率可达74.45%，说明根际菌株分泌铁载体进行拮抗菌初筛的方法可行。铁载体是部分微生物在缺铁条件下分泌的一种小分子量（一般<10 kD）的铁螯合物（Leong，1986），具有极强的螯合Fe3+能力。分泌铁载体的细菌可通过铁载体竞争植物根际周围有限的铁，使病原菌吸收不到足够的铁营养，生长繁殖受到抑制，从而减轻对植物的危害，起到生物防治作用（Masalha et al.，2000）;同时，植物可利用微生物产生的铁载体螯合的铁，从而改善植物的铁营养，对植物生长有一定促生作用（Braud et al.，2009）。

本研究根据菌株Gxun-2形态特征、生理生化特性及系统发育进化树分析，鉴定为铜绿假单胞菌，该菌株除可显著拮抗尖孢镰刀菌外，对其他常见植物病原菌也有较强的拮抗效果。铜绿假单胞菌是一种人类和动物的条件性致病菌，具有较强的感染性和耐药性，常会引起伤口、肺部及尿道感染，是临床上三大条件性致病细菌之一，具有固有和获得性的多重耐药性（Breidenstein et al.，2011;张明亮等，2019）。但近年来分离筛选出一系列具有良好生物防治效果的根际来源铜绿假单胞菌，除分泌铁载体外（Dharni et al.，2012），还可分泌绿脓菌素、藤黄绿脓菌素、吩嗪化合物、胞外多糖及新型抗生素等多种拮抗植物病原菌的代谢产物（Lee et al.，2013），可对多种植物真菌或细菌起到良好防治作用，称之为铜绿假单胞菌生防菌株（Tewari  and Arora，2014）。本研究香蕉枯萎病盆栽防效及促生效果试验结果显示，菌株Gxun-2具有良好的防病和促生作用，但其具体防病促生机理有待进一步探究。目前，选育的铜绿假单胞菌生防菌株在生物防治上的应用仍局限于活菌防治，但由于铜绿假单胞菌无法产生芽孢，常出现生物活菌制剂不稳定、货架期短、有效定殖能力差及田间防治效果不稳定等问题（蒋海霞等，2015）。虽然从植物根际环境中分离出的铜绿假单胞菌与临床分离出的菌株相比致病性较低，但仍不能排除对人体产生毒性的可能性，应注意使用活菌对环境安全性的影响（Wu et al.，2011）。因此，理想的选择是利用铜绿假单胞菌的工程菌或分泌的代谢产物作为微生物源农药进行病害防治。通过基因组学和代谢工程的方法，对具有生防功能的铜绿假单胞菌菌株中的致病相关基因敲除，降低其致病性和细胞毒性;或通过基因工程和代谢工程改造，异源表达銅绿假单胞菌相关活性成分的基因或基因簇，提高抑菌代谢产物的发酵效价，可为微生物农药产业化生产提供安全保障。

4 结论

利用CAS平板筛选具有分泌铁载体能力菌株的方法可高效筛选出拮抗香蕉枯萎病病原菌菌株;筛选出的菌株Gxun-2具有较强的防病促生效果，可作为研制香蕉枯萎病生防菌剂的候选菌株资源。

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（責任编辑 麻小燕）