不同浓度吲哚乙酸对周丛生物微生物群落代谢特性的影响

吴聪敏, 马兰, 吴永红, 俞元春*

(1.南京林业大学生物与环境学院， 南方现代林业协同创新中心， 南京 210037；2.中国科学院南京土壤研究所， 南京 210008)

生长素又叫吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)，是最早发现的在自然界中普遍存在的一类植物激素[7]。IAA作用机理分为两方面，一是使细胞壁软化、松弛，增加细胞的渗透性和可塑性，进而促进细胞伸长；二是促进蛋白质和RNA合成，增加原生质体含量，促进细胞生长[8]。IAA具有多方面的生理效应，也具有“双重作用”，即低浓度促进生长，高浓度抑制生长[9]，可用于植物修复技术[10]。有研究报道，植物和微生物均可产生IAA，如藤黄微球菌[11]、马铃薯根际细菌[12]。IAA可以影响多种微生物的基因表达[13]，也是微生物与植物相互作用中的一种信号分子。Sun等[14]将IAA施加于食虫草后发现，IAA是决定同一生态位真菌种间竞争的主要因素；外源生长素还能促进寄主的病原菌易感性和疾病症状发展[15]。

周丛生物以往都是通过自然形成过程和人工采集方式来富集与培养的，但无法满足生态工程需要。目前已形成较成熟的方法，采用纤维材料富集并使用WC(woods hole culture )培养液作为室内培养基对周丛生物进行扩大培养，但由于载体培育出的周丛生物存在生物量小、群落结构不稳定等弊端，在工业生产等大规模应用中仍具有一定差距。Biology生态测试板是一种常用的可表征群落生理特征的方法[16]。目前通过生态板来分析IAA对周丛生物微生物群落影响的研究较少。本研究利用Biology生态板分析了不同浓度IAA处理对周丛生物微生物群落的代谢功能的影响，探讨了其碳源利用特性，旨在为周丛生物的富集与扩大提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 周丛生物的培育

试验选用南京市玄武湖的水源，按照试验用水与WC培养液体积比为1 000∶11来配置人工废水培养试验所需的周丛生物。试验用水的pH为7.9±0.03，全氮为(1.180±0.02) mg·L-1，NO3--N为(0.670±0.02)mg·L-1，NH4+-N为(0.510±0.01) mg·L-1，全磷为(0.120±0.01) mg·L-1，TDP为(0.035±0.001)mg·L-1。采用长5 cm、宽2 cm的工业弹性材料作为周丛生物的富集载体，加入上述比例配置的人工废水，将其置于恒温培养室培养，期间保持2 500 lx的光照强度，28 ℃温度和12 h/12 h的光暗比。定期观察周丛生物的生长状况，培养20 d后，载体表面出现一层墨绿色粘稠物质，此时周丛生物生长成熟，可进行试验。

1.2 试验设计

将培育好的周丛生物从载体上取下，配置浓度梯度分别为0(CK)、5、10、25、50、100 mg·L-1的吲哚乙酸(国药集团化学试剂有限公司，上海)。每个浓度梯度设置3个平行，先分别向150 mL的锥形瓶中加入1 g含水量为92%～97%的周丛生物(采用烘干法，根据烘干前后周丛生物的质量确定其含水量)，再加入100 mL不同浓度梯度的吲哚乙酸。以对照组为标准，调节溶液的pH。培养室条件：光照强度为2 500～3 000 lx，温度为(28±1) ℃，光暗比为12 h/12 h。

1.3 样品采集与分析

1.3.1周丛生物微生物碳源代谢能力的测定

试验采用含有31种碳源(包含10种糖类、7种羧酸、6种氨基酸、4种多聚物、2种酚酸和2种胺类)的Biology生态测试板来分析周丛生物的微生物群落代谢特征[16]。微生物作用于底物发生氧化还原电位使四氮唑蓝发生氧化还原进行染色，进而对其进行定性和定量检测。

1.3.2生态测试板接种液的配制 在超净工作台中，称取1 g周丛生物置于150 mL无菌锥形瓶中，加入27 mL 0.85%已灭菌的NaCl溶液和灭菌的玻璃珠，封口后，振荡30 min。静置5 min后取5 mL悬液于25 mL V型槽中，再加入20 mL已灭菌的0.85% NaCl，混匀。最后使用移液枪将上述溶液加到每个孔中，每孔150 μL。将接种好的微孔板放在25 ℃的恒温培养箱中培养，分别于24、48、72、96、120、144、168 h在ELXS08-Biology微孔板读数仪(BIO-TEK Instruments INC，USA)上测定590 nm波长下的吸光值。

1.4 数据统计

每组试验均设有3个平行。使用Excel 2013和Origin 2018软件对数据进行统计、绘图；使用SPSS 22.0软件分析数据的差异性。

Biology分析中平均每孔颜色变化率(average well color development，AWCD)与多样性指数[17]的计算方法如下。

AWCD=∑ (Ci-R)/n

(1)

式中，Ci为第i个碳源孔在590 nm波长下的吸光值；R为对照孔的吸光值；n为碳源数(本研究中为31)。

Shannon多样性指数(H)[18]可以表征微生物群落的丰富度，其计算公式如下。

H=-∑(Pi×lnPi)

(2)

Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)

(3)

式中，Pi代表第i个碳源孔吸光度值的相对比值；Ci为第i个碳源孔的吸光值；R为对照孔的吸光度值。

Simpson多样性指数(D)[18]可以反映微生物群落的优势物种，其计算公式如下。

D=1-∑(Pi)2

(4)

Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)

(5)

式中，Pi代表第i个碳源孔吸光度值的相对比值；Ci为第i个碳源孔的吸光值；R为对照孔的吸光度值。

Mclntosh指数(U)[18]用于评估微生物群落的物种相似性与均一性，其计算公式如下。

U=∑(ni)2

(6)

ni=Ci-R

(7)

式中，ni表示第i个碳源孔的相对吸光值；Ci为第i个碳源孔的吸光值；R为对照孔的吸光值。

2 结果与分析

2.1 不同浓度IAA对周丛生物碳代谢活性的影响

施加不同浓度IAA后，周丛生物的平均每孔颜色变化率(AWCD)随时间的变化如图1所示。培养起始的24～96 h内，AWCD快速增长，此时周丛生物微生物碳代谢旺盛；96 h后，各处理的AWCD增长速率逐渐降低，进入平稳期。不同处理下周丛生物的AWCD均呈现出随时间增加而升高的趋势。试验开始后，5、10 mg·L-1低浓度IAA处理下周丛生物的AWCD均低于对照组。培养到72 h后，在不同浓度IAA处理下AWCD之间的差异开始呈现显著性(P<0.05)。96 h时，25、50、100 mg·L-1高浓度IAA处理组的周丛生物AWCD显著高于低浓度处理组的AWCD(P<0.05)。

2.2 不同浓度IAA下周丛生物对不同碳源的代谢能力

由图2可知，在试验96 h时，施加不同浓度IAA处理下周丛生物微生物群落对不同碳源的代谢能力存在差异。50 mg·L-1IAA处理组周丛生物微生物对多聚物的利用能力最高，为1.57，较对照组增加了3.29%。对照组中微生物对多聚物和氨基酸的利用能力较高，分别为1.52和1.26。25、50、100 mg·L-1高浓度IAA处理组可以提高微生物对不同碳源的利用能力和代谢能力，其对酚酸、碳水化合物、胺类的利用能力较对照组较高，而低浓度IAA作用后微生物对羧酸、碳水化合物的利用率与对照相比有所降低。不同处理对酚酸和胺类的利用率之间均无显著性差异。

2.3 不同浓度IAA对微生物碳代谢多样性的影响

由表1可以看出，96 h时5 mg·L-1低浓度IAA处理组周丛生物微生物群落的Shannon指数(H)和McIntosh指数(U)明显低于对照组(P<0.05)，而高浓度处理组的Shannon指数(H)和Simpson指数(D)与对照组相比差异性并不明显。3种代谢多样性指数表明，不同处理下微生物群落之间存在差异，但其优势物种相似。

表1 96 h时周丛微生物碳代谢多样性Table 1 Microbial carbon metabolism diversity of periphytic biofilms at 96 h

3 讨论

平均每孔颜色变化率(AWCD)可用于表示周丛生物微生物群落对不同碳源的利用能力[19]，其值越高表示微生物对碳源的利用率越高，代谢活性也越强[2]。本研究结果表明，不同浓度IAA处理下，周丛生物的活性随着时间的增加而升高。在试验的前24 h内，各浓度IAA处理下微生物对单一碳源的利用程度较低。在培养的24～96 h之间，微生物群落对碳源的利用率显著增加(P<0.05)，且以100 mg·L-1处理下碳源利用率最高，之后缓慢增加，逐渐趋于稳定。培养72 h后，高浓度处理组的AWCD高于对照组，对照组周丛生物AWCD显著高于5、10 mg·L-1低浓度处理组(P<0.05)，表明高浓度IAA处理后周丛生物微生物对碳源的利用率明显提高，微生物的丰度也相对更高。这与Wang等[20]的研究结果一致，随着IAA浓度的升高，变形杆菌门和嗜铬菌门繁殖速度加快，其相对丰度也明显增加。Peng等[21]研究发现，高浓度(50 mg·L-1)IAA处理与对照组相比，微藻的生长增加了30%。

本研究选取96 h的吸光值来评估周丛生物对不同碳源的利用情况，结果发现不同处理下周丛生物微生物群落对不同碳源的利用程度表现不同，但其中多聚物是周丛生物代谢利用率最高的碳源。总体来看，高浓度处理组周丛生物中微生物群落与对照组相比具有更强的碳源利用能力，而低浓度处理组中微生物的碳源利用能力与对照组相比较弱。这与AWCD变化趋势相一致，表明施加IAA后能改变周丛生物的微生物群落结构。不同浓度的IAA对微生物的作用因物种而异，而周丛生物作为一个复杂的微生物聚集体，IAA对其影响应取决于所有微生物的综合作用。

本研究采用96 h的Biology生态测试板测得的AWCD来计算Shannon指数、Simpson指数和Mclntosh指数，真实地反映了周丛生物微生物群落功能多样性的不同侧面。除了Simpson指数以外，剩余两个指标存在显著差异(P<0.05)，说明不同处理后微生物群落具有相似的优势物种。高浓度IAA处理后周丛生物的碳代谢多样性大于等于对照组，而低浓度处理组周丛生物的碳代谢多样性低于对照组，说明施加吲哚乙酸后会引起周丛生物自身组成发生变化，导致其物种多样性也发生变化。高浓度IAA处理能增加周丛生物微生物的多样性，可能是因为周丛生物中存在一些异养微生物，如鲍曼不动杆菌[22]、假单胞菌属[23]等，可以有效利用IAA作为碳源和营养来源，诱导其基因表达，当施加高浓度IAA时，可提供较多的碳源，增加微生物的多样性。Wang等[20]研究发现，高浓度IAA可刺激周丛生物的生长，周丛生物可通过抗氧化酶激活、群落结构优化和碳代谢模式变化来适应不同浓度的IAA。

在本研究中，高浓度IAA处理可以提高周丛生物微生物的碳源代谢和利用能力，为周丛生物的富集与扩大培养提供了思路和途径，但本研究未评估周丛生物的群落结构，需要进一步研究认识这种变化机制。