TGR、LGR5联合RRM1检测在非小细胞肺癌疾病进展中的评估作用

李琪 王继灵 曹荣娟 刘秀珍 孟祥云★

肿瘤生长速率（tumor growth rate，TGR）是近年兴起的一种新型指标，能动态定量观察肿瘤进展速度，适合监测靶向治疗的疗效［1-2］。富含亮氨酸的G 蛋白偶联受体5（Leucine-rich repeat-containing G protein coupled receptor5，LGR5）是结直肠癌干细胞表面标志分子，与肿瘤的生长、侵袭和不良预后相关，近年有研究发现LGR5 在肺癌中也有表达［3-4］。核苷酸还原酶M1（ribonucleotide reductase subunit M1，RRM1）作为核苷酸切除修复的限速酶，是一种抑癌基因，其异常表达与非小细胞肺癌（Non-small-cell carcinoma，NSCLC）的疾病进展、侵袭、转移等亦有紧密联系［5-6］。本研究就既往LGR5、RRM1 在NSCLC 中的意义及预后评估的基础上，进一步研究TGR 与其联合检测在NSCLC 进展中的评估作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年1月至2018年1月于合肥市第二人民医院就诊的97 例NSCLC 患者。纳入标准：①均由组织病理学诊断证实为非小细胞肺癌患者［7］；②均为初次治疗的患者；③有完整的病历资料及影像学图像。排除标准：①多原发恶性肿瘤，有严重基础疾病；②合并弥漫性血管内凝血等血液系统疾病者；③妊娠期或哺乳期妇女。取所有患者术中新鲜肺癌组织及对应癌旁组织（距离癌组织5 cm 处）标本，分别作为NSCLC 组和对照组。本研究经医院医学伦理委员会批准通过，受试者或家属均签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 TGR

通过以下公式计算术前TGR［8］：TGR=100［exp（TG）-1］，其中TG=3log（Dt/D0）/t，D0、Dt 分别为基线及第1 次疗效评价时靶病灶最大直径总和，t 为2 次肿瘤评估间隔的时间。本文遵循实体瘤的疗效评价标准（Response Evaluation Criteria In Solid Tumors，RECIST）［9］标准测量靶病灶，排除基线时仅存在非靶病灶（如仅有胸腔积液或骨转移）及第1 次疗效评价时出现新发病灶的患者。利用受试者操作特征曲线找到TGR 最佳截断点为9.74，以此为界分为TGR 升高和TGR 降低。

1.2.2 LGR5、RRM1

1.2.2.1 主要试剂：兔抗人LGR5 多克隆抗体购自美国Epitomics 公司；RRM1 一抗抗体、二抗和S-P免疫组化试剂盒购自福建迈新生物技术开发有限公司。

1.2.2.2 免疫组织化学检测：将3 mm 厚的石蜡组织切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。体积分数3%过氧化氢处理阻断内源性过氧化物酶，0.01 μmol/L 柠檬酸盐缓冲液（pH 值6.0）高压水浴加热，抗原修复2 min，质量分数3%牛血清白蛋白封闭，阻断非特异性染色。分别以兔抗人LGR5 多克隆抗体（1∶150）与RRM1 一抗抗体为一抗，检测LGR5、RRM1。

1.2.2.3 结果判定标准［10］：RRMl 以细胞浆呈棕黄色为阳性，LGR5 阳性染色为淡黄色、棕黄色或棕褐色，定位于细胞质和细胞膜。阳性细胞百分率（A 值）评分：＜25%为1 分，25%～50%为2 分，＞50%为3 分；染色强度（B 值）评分：不着色为0 分，浅棕黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。两种计分的乘积为每例的加权分数，加权分数为0 为阴性，其余均为阳性。

1.3 随访方法

随访从患者术后开始，直至患者死亡或随访结束，为期3年，截止于2021年1月。随访的方式主以患者来院复查为主，随访率为100.00%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，计数资料以n（%）表示，行χ2检验；计量数据以（）表示，行t检验；采用多元Logistic 回归分析影响预后生存的危险因素，采用ROC 曲线分析不同方法的预测价值，绘制Kaplan-Meier 生存曲线研究TGR、LGR5、RRM1 对患者预后生存的影响；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组TGR、LGR5、RRM1 表达情况比较

NSCLC 组LGR5 阴性率及RRM1 阳性率高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组TGR、LGR5、RRM1 表达情况比较［n（%）］Table 1 expression comparison of TGR，Lgr5 and RRM1 between the two groups［n（%）］

2.2 TGR、LGR5、RRM1 表达与NSCLC 患者病理参数的相关性

中低分化、Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结侵犯者TGR 升高率、LGR5 阴性率及RRM1 阳性率高于高分化、Ⅰ+Ⅱ期及无淋巴结侵犯者，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 TGR、LGR5、RRM1 表达与NSCLC 患者病理参数的相关性［n（%）］Table 2 Correlation between expression of TGR，Lgr5 and RRM1 and pathological parameters of NSCLC patients［n（%）］

2.3 影响NSCLC 患者预后生存的单多因素分析

截至随访结束，97 例NSCLC 患者生存59 例，死亡38 例，死亡率为39.18%。中低分化、Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结侵犯、TGR 升高、LGR5 阴性及RRM1阳性表达为影响NSCLC 患者预后生存的独立危险因素（P＜0.05）。见表3。

表3 影响NSCLC 患者预后生存的单因素和多因素分析Table 3 univariate and multivariate analysis of prognostic factors in patients with NSCLC

2.4 TGR、LGR5 联合RRM1 检测在预测NSCLC患者预后生存中的价值分析

TGR、LGR5、RRM1 单项及联合检测AUC 分别为0.820、0.715、0.821、0.905，各指标AUC 以联合检测最大（P＜0.05）。见表4、图1。

图1 ROC 曲线Figure 1 ROC curve

表4 TGR、LGR5、RRM1 单项及联合检测水平对预测NSCLC 患者预后生存的预测价值Table 4 predictive value of TGR，Lgr5，RRM1 single and combined detection levels in predicting prognosis and survival of NSCLC patients

2.5 TGR、LGR5、RRM1 与NSCLC 患者预后生存的关系

TGR 高表达的平均生存时间为（29.87±2.42）个月，低于TGR 低表达组平均生存时间（41.09±6.42）个月，差异有统计学意义（t=11.534，P＜0.05）。LGR5 阴性组的平均生存时间为（31.65±2.09）个月，低于LGR5 阳性组平均生存时间（39.35±4.47）个月，差异有统计学意义（t=6.309，P＜0.05）。

RRM1 阴性组的平均生存时间为（38.64±3.85）个月，高于RRM1 阳性组平均生存时间（32.11±2.72）个月，差异有统计学意义（t=5.880，P＜0.05）。见图2。

图2 不同TGR、LGR5、RRM1 表达情况下Keplan-meier生存曲线Figure 2 Keplan-meier survival curve under the circumstance of different expressions of TGR，LGR5 and RRM1

3 讨论

TGR 定义为1 个月内肿瘤体积增加的百分比［11］。目前研究发现，TGR 在肾癌、乳腺癌、结直肠癌等多种肿瘤中与总体生存期（Overall Survival，OS）显著相关，尤其在肾癌领域，TGR 已经进入临床决策层面，直接影响治疗方案的选择及预后的评估［12-13］。因此，TGR 可能成为评价抗肿瘤治疗是否改变疾病进程的有用工具。本研究结果显示，在NSCLC 组织中以TGR 升高为主，且TGR 与NSCLC 多种病理参数关系密切，提示TGR 升高促进NSCLC 的侵袭与转移。Kaplan-Meier 生存曲线分析结果显示TGR 升高人群生存期短、预后差，与既往研究［14］趋势类似，进一步提示临床可加强对NSCLS 患者TGR 的检测，进而改善预后。

LGR5 是含有18 个富含亮氨酸的重复单位和7 个跨膜区域组成的大分子蛋白，为G 蛋白偶联受体家族的成员之一。国外研究显示：LGR5 在人体正常组织中的表达表现出局限性，而在卵巢、胃肠道、基底细胞癌及肝脏等肿瘤组织中，LGR5 的表达均有不同程度的改变［15］。本研究结果基本与上述研究一致，提示了LGR5 在癌症的发生、发展中可能起到了至关重要的作用。此外，研究发现LGR5 是Wnt 信号通路中的靶基因，当信号通路异常激活时，引起LGR5 的表达显著降低，可能对NSCLC 癌组织中上皮细胞的恶性转化起到重要作用［16］。而本组数据Kaplan-Meier 生存曲线中显示LGR5 阴性组生存时限低于阳性组，提示LGR5 的表达与非小细胞肺癌患者预后生存有着密切联系。

核苷酸还原酶（ribonucleotide reductase，RR）是一种限速酶，在DNA 合成通路中起作用。目前，临床上对于RRM1 的研究主要集中于其表达水平与恶性肿瘤患者预后相关性。相关研究显示，RRM1 表达直接影响到了NSCLC 化疗耐药性［17］。本组数据显示：NSCLC 患者RRM1 阳性表达率显著升高，是影响患者预后生存的独立危险因素，且进一步Kaplan-Meier 生存曲线分析得RRM1 阳性患者平均生存时间显著短于阴性组提示RRM1 检测对NSCLC 患者疾病进展及预后具有积极的预测作用。ROC 曲线结果显示各指标AUC 以联合检测最大，故联合检测的预测价值最佳，表明TGR、LGR5、RRM1 三项联合提高了临床评估NSCLC 患者预后的敏感度，值得在临床广泛推广。

综上所述，TGR、LGR5、RRM1 与NSCLC 疾病进展、预后均有着密切关系，可作为预测患者预后生存的分子标志物和肿瘤治疗的潜在靶点。