miRNA-10a、GATA6在肝细胞癌组织中的表达及意义

余袁媛 曾新桃

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原发性肝癌最为常见的类型，是我国恶性肿瘤相关死亡的主要原因［1］。HCC 的发生与长期大量饮酒、丙型病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、乙型病毒性肝炎等因素相关，我国HCC 发生的主要原因是乙型病毒性肝炎［2］。现阶段临床对HCC 的发病机制及诊疗取得了进展，但少数患者术后存在转移或复发，严重影响了患者的预后［3］。因此，寻找新的肿瘤标志物对临床指导治疗、准确评估预后具有重要的价值。微小RNA（microRNA，miRNA）作为一类非编码RNA，能与mRNA 结合阻断蛋白编码基因的表达［4］。临床研究发现，微小RNA-10a（microRNA-10a，miRNA-10a）能进入线粒体调控癌基因的表达，与多种恶性肿瘤的关系密切［5］。核转录因子GATA6（GATA-binding protein 6，GATA6）是一种转录调节因子，有研究发现，GATA6 异常表达于多种肿瘤疾病中，能影响恶性肿瘤的发生和发展［6］。本研究将探讨miRNA-10a、核转录因子GATA6在HCC 组织中的表达及意义，以期为临床HCC诊疗提供参考，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院2017年6月至2019年6月92 例经手术切除治疗的HCC 患者，术后取癌组织及癌旁组织。纳入标准：①满足《原发性肝癌诊疗规范》［7］中诊断标准，并经病理学检查确诊；②首次确诊；③术前未接受免疫治疗或放化疗；④本研究经医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。排除标准：①继发性肝细胞癌；②合并自身免疫性疾病、感染性疾病者；③存在其他恶性肿瘤者；④肝癌复发者；⑤肾、心、肺等其他重要脏器严重损伤者；⑥临床病理资料不完整者。92 例HCC 患者中男性63 例，女性29 例；年龄平均（52.61±6.02）岁；TMN 分期：Ⅰ期12 例，Ⅱ期28 例，Ⅲ期52 例；分化程度：低分化43例，中分化28 例，高分化21 例；乙肝40 例，肝硬化45 例；淋巴结转移44 例；肿瘤直径＞5 cm 30 例。

1.2 方法

1.2.1 标本采集与保存

收集HCC 患者癌组织及癌旁正常组织（距离肿瘤边缘＞5 cm），经快速液氮冷冻后送至标本库，于-80℃环境保存备用。

1.2.2 miRNA-10a、核转录因子GATA6mRNA检测

取50 mg 组织标本，进行冰上研磨，并按TRIzol 说明书进行组织RNA 提取，根据逆转录试剂盒说明合成cDNA，使用分光光度计鉴定cDNA纯度，确保A260/A280 在1.8～2.0，并置于-20℃冰箱储存。TRIzol 试剂、逆转录试剂盒均购自美国Invitrogen 公司，采用RT-PCR 法检测miRNA-10a、核转录因子GATA6 mRNA 水平，取GAPDH 为内参物。miRNA-10a 上游引物序列：5′-ACATCATACCCTGTAGAACCGAA-3′，下游引物序列：5′-GATTGGATGTTCTCCACAGTCTC-3′；GATA6 mRNA 上游引物序列：5′-CTCAGTTCCTACGCTTCGCAT-3′，下游引物序列：5′-GTCGAGGTCAGTGAACAGCA-3′；GAPDH 上游引物序列：5′-CTGCAGCATCTTCTCCTTCC-3′，下游引物序列：5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′。扩增条件如下：95℃5 min；95℃15 s 进行变性，60℃60 s 进行退火，72℃5 min 30 s 进行延伸，此为1 个循环，共进行40 个循环，实时定量PCR 测定，以2-ΔΔCt法计算miRNA-10a、核转录因子GATA6mRNA 相对表达量，具体步骤严格遵循试剂盒说明书进行。

1.3 随访

对患者进行18 个月随访，随访方式为电话或门诊复诊，记录随访结果（存活或死亡）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行统计分析。符合正态分布的计量数据以（）表示，组间比较采用t检验；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验；采用Cox 比例风险回归模型分析影响HCC 患者预后的危险因素。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC 患者癌组织及癌旁组织中miRNA-10a、GATA6 mRNA 表达水平比较

HCC 患者癌组织miRNA-10a、GATA6mRNA相对表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 HCC 患者癌组织及癌旁组织中miRNA-10a、GATA6 mRNA 表达水平比较（±s）Table 1 Comparison on the expression levels of miRNA-10a and GATA6 mRNA in cancer tissues and para-cancerous tissues in HCC patients（±s）

表1 HCC 患者癌组织及癌旁组织中miRNA-10a、GATA6 mRNA 表达水平比较（±s）Table 1 Comparison on the expression levels of miRNA-10a and GATA6 mRNA in cancer tissues and para-cancerous tissues in HCC patients（±s）

组织类型癌组织癌旁组织t 值P 值n 92 92 miRNA-10a 1.97±0.35 0.65±0.13 33.911＜0.001 GATA6 mRNA 3.53±0.71 1.41±0.28 26.643＜0.001

2.2 不同临床病理特征HCC 患者癌组织中miRNA-10a、GATA6 mRNA 表达水平比较

HCC 患者癌组织中miRNA-10a、GATA6mRNA 表达水平与TMN 分期、分化程度、乙肝、肝硬化、淋巴结转移、肿瘤直径有关（P＜0.05），与年龄、性别无关（P＞0.05）。见表2。

表2 不同临床病理特征HCC 患者癌组织中miRNA-10a、GATA6 mRNA 表达水平比较［n（%）］Table 2 Comparison on the expression levels of miRNA-10a and GATA6 mRNA in cancer tissues among HCC patients with different clinicopathological characteristics［n（%）］

2.3 影响HCC 患者预后的相关因素分析

随访18 个月结果显示，92 例HCC 患者，失访2例，存活53 例，死亡37 例，存活率为58.89%。排除2 例失访患者后采用Cox 比例风险回归模型进行分析，结果显示：TMN 分期增高、中高分化、乙肝、肝硬化、淋巴结转移、肿瘤直径≥5 cm、miRNA-10a、GATA6mRNA 表达水平过高是影响HCC 患者预后的独立危险因素（P＜0.05）。见表3。

表3 影响HCC 患者预后的危险因素分析Table 3 Risk factors affecting prognosis of HCC patients

3 讨论

HCC 早期缺乏典型症状，多数患者确诊时已处于中晚期，错过了最佳治疗时机，导致预后较差、生存期短［8］。因此，临床需要寻找合理的肿瘤标志物评估HCC 复发及转移风险，进一步为临床HCC 治疗提供依据。

miRNAs 能调控靶基因表达，对细胞生长、分化及凋亡等生理过程产生影响，近年来的研究表明miRNAs 与肿瘤的发生及进展等过程密切相关［9-10］。miRNA-10a 是位于17 号染色体的miRNA，与恶性肿瘤的侵袭及转移密切相关［11］。国内研究发现，在胰腺癌患者组织中miRNA-10a 表达水平升高，且上调miRNA-10a 表达可以促进胰腺癌细胞增殖及迁移［12］。国外研究发现，miRNA-10a 在子宫颈癌组织中呈高表达，并可以调节靶基因-神经细胞黏附分子，促进宫颈癌浸润及淋巴细胞转移，进而影响预后［13-14］。有报道显示，miRNA-10a 在胃癌中呈高表达，且可以直接靶向MAFK8IP1，调控肿瘤转移［15］。本研究结果显示，HCC 患者癌组织中miRNA-10a 表达水平高于癌旁组织，提示miRNA-10a 可能作为癌基因参与了HCC 的发生。有研究发现，miRNA-10a 表达上调可能会使EphA4表达减少，进而在一定程度上促进肝癌细胞发生侵袭及转移［16］。本研究结果表明miRNA-10a在HCC的进展过程中可能发挥着癌基因作用。本研究结果显示，随着TMN 分期的增加，miRNA-10a 表达上调，且存在淋巴结转移的HCC 患者癌组织中miRNA-10a出现高表达的占比高于无淋巴结转移者，这进一步证明了miRNA-10a 参与了HCC 的侵袭和转移。

GATA6 是位于18 号染色体的核转录因子，可与半限制转录因子通过相互作用来调控机体细胞类型特化，与多种肿瘤的发生及发展密切相关［17］。国外研究发现，GATA6 具有保守、稳定的锌指结构，对肿瘤细胞增殖有促进作用，对肿瘤细胞凋亡有抑制作用［18］。提示GATA6作为原癌基因在HCC患者癌组织中高度表达，与上述研究结果一致。闫江鹤等［19］认为，癌细胞在GATA6 作用下会释放大量的细胞黏附分子，细胞黏附分子含量升高会导致癌细胞与内皮细胞紧密黏附，有利于癌细胞穿透细胞外基质层，建立转移灶。进一步分析结果提示GATA6 参与了HCC 的局部浸润及远处转移，可作为HCC 发生侵袭性生物学行为的标志物。对影响HCC 患者预后的危险因素分析可见，TMN 分期增高、中高分化、乙肝、肝硬化、淋巴结转移、肿瘤直径≥5 cm、miRNA-10a、GATA6mRNA 表达水平过高是影响HCC 患者预后的独立危险因素，进一步提示miRNA-10a、GATA6 表达与HCC 患者临床预后的关系密切，临床可以通过检测miRNA-10a、GATA6 表达情况，评估HCC 患者的预后情况。

综上所述，miRNA-10a、核转录因子GATA6 在HCC 患者癌组织中呈高表达，其表达水平与TMN分期、分化程度、乙肝、肝硬化、淋巴结转移、肿瘤直径及预后有关。