FSH-PI3K/AKT/NF-κB蛋白在上皮性卵巢癌组织中的表达及作用机制

路晓琳

卵巢癌是女性常见恶性肿瘤，据统计，上皮性卵巢癌5年生存率仅为30%～40%，死亡率居于妇科恶性肿瘤首位［1-2］。激素环境与卵巢癌发生发展密切相关，过量卵泡刺激素（Follicle stimulating hormone，FSH）刺激可能是卵巢癌发生的重要危险因素［3］。有文献证实，FSH 通过作用于细胞表面FSH 受体（FSHR）促使细胞内相关信号通路被激活，从而在卵巢癌中发挥作用，但具体作用机制仍有待探讨［4］。研究显示，磷脂酞肌醇3 激酶/蛋白激酶B（Phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）通路在恶性肿瘤发生发展中具有重要作用［5］。核转录因子κB（Nuclear transcription factor κB，NF-κB）属于信号通路的中枢，与细胞增殖、凋亡联系紧密［6］。因此，本研究尝试探究FSHPI3K/AKT 信号通路-NF-κB 蛋白对上皮性卵巢癌发生发展的影响，旨在为临床制定治疗方案提供依据。报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选取邯郸市中心医院2015年7月至2016年10月手术切除的上皮性卵巢癌组织（32 例）、卵巢交界性肿瘤组织（32 例）、卵巢良性肿瘤组织（32例）、正常卵巢组织（32 例）作为研究资料来源，采用搔刮法对人卵巢表面上皮细胞进行原代培养，SKOV-3 细胞株为北京大学人民医院妇科实验室提供；3AO 细胞株为河北医科大学第四医院实验中心提供，均用常规RPMI-1640 培养基培养；注射用重组人卵泡刺激素来自瑞士Laboratoires Serono SA 公司；LY294002 来自美国Promega 公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化法

将4 种卵巢标本组织芯片进行4 μm 切片，敷贴在处理好的载玻片，置入烤箱中加热（0.5～1 h），采用免疫组化法检测4 种卵巢组织中表达FSHR、p-AKT、NF-κB 蛋白的细胞比例。判定标准［7］：阳性细胞＞50%为3 分，21%～50%为2 分，10%～20%为1 分，＜10%为0 分；细胞染色强度：黄褐色为3 分；黄棕色为2 分；浅黄色为1 分，无黄色为0 分。细胞染色强度与阳性细胞比例积分的乘积为最终积分，＜3 分判定为阴性，≥3 分判定为阳性。

1.2.2 四甲基偶氮唑蓝（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法［8］

取对数生长期SKOV-3、3AO 细胞经胰酶消化后，调整细胞浓度为1×105/mL，每孔100 μL 培养于96 孔培养板中，培养6～8 h，待细胞贴壁后，调整培养液，分为只加培养基不加细胞的空白对照组、不含药培养基的对照组、FSH 单独处理的FSH 组、LY294002 单独处理的LY 组及LY294002 作用0.5 h 后联合FSH 的FSH/LY 组，每组设5 个复孔，重复3 次。分别培养12、24、48、72 h 后，吸出含药培养基，采用MTT 法检测药物对SKOV-3、3AO 细胞生长促进作用及其与时间和浓度的关系。细胞生长增殖率=（A 加药-A 空白）/（A 对照-A 空白）×100%。

1.2.3 Western blot 蛋白印迹法

待上皮性卵巢癌细胞SKOV-3、3AO 经40 mIU/ml FSH（FSH 组）、10 μmol/L LY294002（LY组）、加入LY294002 0.5 h 后联合FSH（FSH/LY 组）处理，并设对照组，分别于48 和24 h 后倒掉培养液，制作离心上清液，置于-70℃条件下保存，进行SDSPAGE 电泳、转膜、封闭、加一抗、二抗、洗膜、化学发光、显影、定影、凝胶图像分析，观察FSH 和LY294002 分别及序贯联合作用于SKOV-3、3AO 细胞前后FSHR、AKT1/2、p-AKT、NF-κB 蛋白的表达。

1.2.4 Transwell 小室侵袭实验

调整细胞浓度为1×105/mL，每孔上层小室中加200 μL 细胞悬液，24 孔板槽中加入500 μL 含10%胎牛血清的培养基。待细胞贴壁后，用FSH 40 mIU/mL 和LY294002 10 μmol/L 分别及序贯联合作用于细胞，48 h 后结晶紫染色，显微镜下观察上层小室底部穿过的细胞情况并计数。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 22.0 进行统计学分析，计数资料采用n（%）表示，行χ2检验对比，计量资料以（）描述，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两组间比较采用LSD-t 检验，两组间比较采用独立样本t检验，相关性采用Spearman 相关性模型分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同卵巢组织FSHR、p-AKT、NF-κB 蛋白阳性表达细胞比率

上皮性卵巢癌组织FSHR、p-AKT、NF-κB 蛋白阳性表达率：卵巢交界性肿瘤组织＞卵巢良性肿瘤组织＞正常卵巢组织（P＜0.05），卵巢交界性肿瘤组织、卵巢良性组织、正常卵巢组织比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 不同卵巢组织中FSHR、p-AKT、NF-κB 蛋白阳性表达率比较［n（%）］Table 1 FSHR，p-Akt，NF in different ovarian tissues-κ Comparison of the positive expression rate of B proteinn［n（%）］

2.2 上皮性卵巢癌组织中FSHR、p-AKT、NF-κB蛋白表达相关性

Spearman 相关性分析，上皮性卵巢癌组织中FSHR 与p-AKT、NF-κB 蛋白表达呈正相关（r=0.671、0.759，P均＜0.001），p-AKT 与NF-κB 蛋白表达呈正相关（r=0.718，P＜0.05）。

2.3 FSH 对SKOV-3、3AO 细胞生长促进作用及其与时间和浓度的关系

SKOV-3 细胞于FSH 浓度40 mIU/mL 作用48 h 时细胞增殖率最大。不同浓度比较差异有统计学意义（P＜0.05）；不同时间点比较差异无统计学意义（P＞0.05）；3AO 细胞于FSH 浓度40 mIU/mL作用24 h 时细胞的增殖率最大，最大增殖率为（173.92±1.92）%。不同浓度、不同时间点比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 FSH 对SKOV-3、3AO 细胞生长促进作用及其与时间和浓度的关系（±s）Table 2 growth promoting effect of FSH on SKOV-3 and 3AO cells and its relationship with time and concentration（±s）

表2 FSH 对SKOV-3、3AO 细胞生长促进作用及其与时间和浓度的关系（±s）Table 2 growth promoting effect of FSH on SKOV-3 and 3AO cells and its relationship with time and concentration（±s）

注：a vs b vs c vs d vs e P＜0.05；A vs B vs C vs D P＞0.05。

细胞SKOV-3 细胞3AO 细胞FSH（mIU/mL）10a 20b 40c 80d 160e F 值P 值10a 20b 40c 80d 160e F 值P 值12 hA 137.26±0.71 141.02±1.25 143.94±1.00 139.71±0.75 141.65±1.18 193.687＜0.001 106.13±4.12 113.07±2.62 117.45±1.04 114.23±4.36 113.15±1.36 59.722＜0.001 24 hB 145.57±1.06 148.18±0.69 151.82±0.91 143.39±1.03 142.14±1.56 407.135＜0.001 114.11±2.05 139.93±5.90 173.92±1.92 172.15±3.14 154.14±2.54 1671.452＜0.001 48 hC 147.45±0.84 153.17±0.95 166.92±1.24 163.26±0.62 161.05±0.87 2337.144＜0.001 109.72±2.22 127.98±3.05 167.91±3.24 158.38±2.34 140.05±1.53 2673.086＜0.001 72 hD 137.60±2.24 144.58±0.75 151.13±1.32 137.48±0.93 131.79±1.05 960.340＜0.001 109.34±6.52 118.17±3.33 142.04±5.36 130.00±2.10 122.09±3.01 256.143＜0.001

2.4 FSH、LY294002 及联合对SKOV-3、3AO 细胞FSHR、p-AKT、AKT1/2、NF-κB 表达的影响

SKOV-3 细胞中，与对照组相比，FSH 组p-AKT 蛋白表达增加，LY294002 组、FSH/LY294002组p-AKT 蛋白表达减少（P＜0.05）；FSH 组NF-κB蛋白表达高于LY294002 组（P＜0.05）；3AO 细胞中，LY294002 组、FSH/LY294002 组p-AKT 蛋白表达少于对照组（P＜0.05），FSH 组p-AKT 蛋白表达高于对照组、LY294002 组、FSH/LY294002 组（P＜0.05）；FSH 组胞核中NF-κB 蛋白表达高于对照组、LY294002 组、FSH/LY294002 组（P＜0.05）；LY294002 组、FSH/LY294002 组少于对照组，但无统计学差异（P＞0.05）；4 组SKOV-3、3AO 细胞AKT1/2 蛋白表达无明显差异（P＞0.05）。见表3。

表3 FSH、LY294002 及联合对SKOV-3、3AO 细胞FSHR、p-AKT、AKT1/2、NF-κB 表达的影响Table 3 Effects of FSH，LY294002 and their combination on FSHR，p-Akt，AKT1/2 and NF in SKOV-3 and 3AO cells-κ The influence of B expression

2.5 FSH、FSH/LY、LY 对SKOV-3、3AO 细胞的侵袭性

对照组、FSH 组、FSH/LY294002 组、LY294002组SKOV-3 细胞穿过基质膜平均细胞数分别为（26±6）、（118±19）、（38±7）、（18±5）个/高倍镜（×200）；3AO 细胞穿过基质膜平均细胞数分别为（19±4）、（134±20）、（58±11）、（12±3）个/高倍镜（×200）。对照组、LY294002 组、FSH/LY294002 组两种细胞穿过小室的细胞数少于FSH 组（P＜0.05）。见图1。

图1 FSH、FSH/LY、LY 对SKOV-3、3AO 细胞的侵袭性Figure 1 Invasiveness of FSH，FSH /ly and ly on SKOV-3 and 3AO cells

3 讨论

国内卵巢癌中80%～90%为上皮性卵巢癌，普遍认为与遗传、环境、内分泌等因素有关［9］。近年来，随着分子生物学在恶性肿瘤发病机制中的研究不断进步，细胞因子及相关信号通路与恶性肿瘤发生发展的关系为探索肿瘤发生、增殖、侵袭提供了新思路、新途径。

FSH 是腺垂体分泌的糖蛋白激素，主要作用是加速窦前卵泡、窦状卵泡颗粒细胞增殖分化，激活颗粒细胞芳香化酶促进雌二醇等物质合成、分泌，在女性内分泌和生殖功能中具有重要作用［10］。相关研究表明，FSH 与卵巢癌发生发展有关，且在卵巢癌组织表面上皮有FSHR 的表达，说明FSH 的确参与卵巢癌发生发展过程［11］。本研究结果显示，SKOV-3 细胞于FSH 浓度40 mIU/mL 作用48 h 时细胞增殖率最大，具有浓度依赖性，3AO细胞于FSH 浓度40 mIU/mL 作用24 h 时细胞的增殖率最大，具有时间-浓度依赖性，对照组、LY294002 组、FSH/LY294002 组两种细胞穿过小室的细胞数少于FSH 组，与闫晓楠等［12］研究报道结果一致，说明FSH 能够促进上皮性卵巢癌细胞株SKOV-3、3AO 生长、增殖、侵袭的作用。本研究还显示，上皮性卵巢癌组织FSHR、p-AKT、NF-κB 蛋白阳性表达率高于卵巢交界性肿瘤组织、卵巢良性肿瘤组织、正常卵巢组织，且上皮性卵巢癌组织中FSHR、p-AKT、NF-κB 蛋白之间呈正相关，提示FSH 在上皮性卵巢癌发生发展中的作用可能与p-AKT、NF-κB 蛋白有关。PI3K/Akt 信号通路是一种以促增殖、抗凋亡为主要作用的信号传导通路，其中PI3K 属于磷脂酰肌醇依赖激酶家族成员，在调节细胞骨架构筑、细胞增殖、分化过程中发挥重要作用，Akt 属于该通路最主要的靶酶，活化形式为p-Akt，可抑制细胞凋亡［13］。已有报道证实，NF-κB蛋白作为PI3K/Akt 信号通路的下游分子，是AKT抗凋亡信号的靶点，可导致肿瘤细胞不能及时凋亡，促使肿瘤细胞增殖，加速恶性肿瘤发生［14］。

本研究表明，SKOV-3、3AO 细胞中，与对照组相比，FSH 组p-AKT 蛋白、胞核中NF-κB 蛋白表达增加，LY294002 组、FSH/LY294002 组p-AKT 蛋白表达减少，胞核中NF-κB 蛋白略有减少，说明FSH 可能是经由PI3K/Akt 通路上调卵巢癌细胞株SKOV-3、3AO 中NF-κB 的表达，促进肿瘤细胞增殖、侵袭，在PI3K 抑制剂LY294002 的特异性抑制作用下，p-AKT蛋白、胞核中NF-κB 蛋白呈下调趋势。分析原因，可能是由于FSH 通过结合细胞膜上的FSHR，激活PI3K，促使Akt 磷酸化，从而导致PI3K/Akt 信号通路异常活化，并通过降解作用促使NF-κB 从复合物中解离，转位至细胞核中，引发其转录活性，进而加快细胞增殖、侵袭，经LY294002 处理后FSH 作用被逆转，对PI3K/Akt 信号通路异常活化产生抑制作用，阻滞NF-κB 核移位，最终下调卵巢癌细胞增殖、侵袭能力［15］。因此，FSH-PI3K/AKT 信号通路-NF-κB 蛋白有望成为临床治疗上皮性卵巢癌的新靶点。

综上可知，FSH 可能经由PI3K/Akt 通路上调NF-κB 的表达，促进上皮性卵巢癌肿瘤细胞增殖、侵袭。