液相色谱一串联质谱法测定血清中尿素含量

唐强

摘 要：针对传统血清中尿素含量测定方法操作困难，准确度低的问题，提出液相色谱一串联质谱法测定尿素中血清含量。分别对两种浓度水平下水清中尿素浓度定值，精准测试盲样中尿素含量。全面分析了影响血清中尿素含量的因素，并根据分析结果对其不确定度进行评价。结果表明：液相色谱一串联质谱法测定血清中尿素含量相对偏差（RSD）均小于1%。对两种浓度水平的血清进行測定，不确定度分别为1.2%和0.84%，这就证明本文所建立的方法测量血清中尿素含量比较准确，且原理比较可靠，定量比较准确，前处理简单，可以当做血清中尿素含量测定的候选参考方法。

关键词：血清;尿素;同位素稀释质谱法;液相色谱

中图分类号：R446.1 文献标识码：A     文章编号：1001-5922（2021）10-0033-04

Determination of Urea in Serum by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

Tang Qiang

（Hunan College of Foreign Studies， Changsha 410116， China）

Abstract：Aiming at the problems of difficult operation and low accuracy of traditional methods for the determination of urea in serum， a liquid chromatography tandem mass spectrometry method was proposed to determine the content of urea in serum. Determine the concentration of urea in the water at two concentration levels， and accurately test the urea content in the blind sample. The factors affecting the content of urea in the serum were comprehensively analyzed， and the uncertainty was evaluated based on the analysis results. The results showed that the relative deviation （RSD） of urea content in serum determined by liquid chromatography tandem mass spectrometry was less than 1%. The uncertainty of urea in two concentrations of serum was 1.2% and 0.84% respectively， which prove that the method established in this paper is more accurate in measuring serum urea content， and the principle is more reliable， the quantification is more accurate， and the pretreatment is simple， it can be used as a candidate reference method for the determination of urea content in serum.

Key words：serum; urea; isotope dilution mass spectrometry; liquid chromatographypounds

尿素是人体内氨基酸分解代谢的产物，受肝脏功能和蛋白质摄入量影响。在临床医学中，尿素代谢是反映肾功能情况的非特异性性指标，也是在正常人普通饮食的情况下，一项较为敏感的指标。因此，准确检测血清中尿素含量是临床医学中，非常重要的一项研究。目前较为常见的血清中尿素测定方法有脲酶速率法[1]、离子电导法[2]、二乙酰肟法[3]，这些方法虽然能够检测出血清中尿素的含量，但精准度还需要进一步提高。针对以上方法存在的问题，张鹏[4]提出气相色谱/同位素稀释质谱法，为病人血清提供了一个高度准确的测定工具。但该方法存在测试过程困难，衍生化试剂使用条件严格，衍生化反应所需时间长，步骤繁琐的问题，使得尿素的测定出现新的难题。基于此，文章尝试对气相色谱/同位素稀释质谱法进行改进，将液相色谱作为分离系统，以串联质谱作为检测系统，对血清中尿素含量进行测定，并对其不确定度因素进行分析，为血清中尿素含量测定提供参考方法。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

本试验主要材料为：人血清干粉（上海极威生物科技有限公司，GR）、尿素标记物（内蒙鄂尔多斯联合化工，纯度>99%）、尿素纯品标准物质（国家标准物质研究中心，纯度99.9%，不确定度0.2%，k=2）、甲醇（武汉强松精细化学品有限公司，高效液相色谱级）、乙腈（泉州市一海三路科技有限公司，高效液相色谱级）。

本试验主要设备为：电子天平（济南好来宝医疗器材有限公司，BSA124S）、超低温冰箱（济南鑫贝西生物技术有限公司，BDF-86V50）、移液器（河北慧采科技有限公司，C9722）、旋涡振荡器（济南爱来宝仪器设备有限公司，88882010）、液相色谱一串联质谱仪（上海佐明机械设备贸易有限公司，6410B）。

1.2 试验原理

试验主要使用液相色谱一串联质谱联用技术（LC-MS/MS）检测血清中尿素含量。将液相色谱作和串联质谱分别作为分离系统和检测系统。在分析血清中尿素含量时，提前对血清样品进行相关处理，然后将其导入液相色谱部分，让处理过的血清樣品在液相色谱中完成流动相分离的过程。样品被离子化后，经过质谱的质量分析器按质量数将离子碎片分开，然后再由检测器得到质谱图[5]。液相色谱一串联质谱联用技术在热不稳定化合物的分析测定、机型化合物的分析测定、不挥发性化合物分析测定和大分子量化合物的分析方面进行测定。液相色谱一串联质谱联用技术具体组成如图1所示[6]。

1.3 试验方法

1.3.1 血清样品的制备

（1）从超低温冰箱中取出经过处理的血清样品，在室温条件下静置，待其达到平衡。将5ml高纯三次水与血清干粉混合均匀，称量记录水的质量。

（2）将一定体积的13C和15N2尿素标记物放入待测样品中，13C和15N2的加入量需要根据尿素浓度确定。加入标记物后，其余尿素含量比值大约为1∶1。准确称量血清重量并记录。

（3）将血清震荡混合均匀后，置于室温环境下平衡1h，加入血清1/3体积的乙腈试剂，混合均匀静置，等待蛋白质沉淀后，将上层清液取出，用乙腈试剂将上层清液稀释至1μg/g后，用有机相滤膜进行过滤，用ID-LC/MS/MS进行分析。尿素测量条件如表1、表2所示[7-8]。

1.3.2 分析过程

（1）将4个校准比值混合溶液进行进样，进样顺序为从低标到高标。对混合溶液中尿素含量进行测定，每个标准进行3次平行试验，取其平均值为最终结果。将尿素和尿素标记物质量比值作为评定标准，根据RSD确定其准确度，若结果RSD大于1%，则该结果不可用，试验数据舍去，全部重新开始。将尿素与尿素标记物质量比对峰面积作图，考查曲线线性回归方程平方，根据考察结果判断其准确度，若考查结果比0.999小，则试验数据舍弃，重新进行试验。

（2）血清样品和其对应校准比值混合溶液一起进行分析测定，进样次序为样品掺杂在高低标之间，若结果RSD大于1%，则该结果不可用，试验数据舍去，全部重新开始。进行3次平行试验，将平均值作为最终结果。

2 结果与讨论

2.1 血清测定结果

表3、表4分别为两种浓度血清（血清A和血清B）括号法动量测试结果。以此结果进行不确定度的分析。

2.2  不确定度分析

通过计算公式可以知道影响血清中尿素含量测试结果的因素，主要由随机因素和系统因素构成。在此对影响血清中尿素含量因素的影响进行详细分析。

2.2.1 随机因素不确定度分析

随机因素产生的不确定度主要是由测量变动引起的，因此可用测量结果标准偏差表示随机因素不确定度，为简化计算过程，这里的标准偏差为相对标准偏差[9-10]。

2.2.2非随机因素不确定度分析

（1）称量的不确定度。在分析过程中，主要有校准物、校准溶液、标记物、标记物溶液、血清样品称量，在称量的过程中，都有可能造成一定不确定度。

工作标记物溶液和工作校准溶液的称量比100mg高，电子天平最大不确定度为0.05mg，则工作标记物和校准溶液相对不确定度为0.05/100=0.05%;纯品校准物重量比20mg多，天平最大不确定度为5.0μg，则纯品校准物不确定度为0.005/20=0.025%;标准储备液重量大于1g，天平不确定度为0.05mg，则标准储备液不确定度为0.005/100=0.005%;血清样品重量超过100mg，天平不确定度为0.05mg，则血清样品不确定度为0.05/300=0.17%。

（2）校准物纯度不确定度。由标准物质证书给出校准物质纯度不确定度。

2.3   不确定度计算

2.3.1 尿素测定不确定度

（1）校准标准物质纯度带来的不确定度UB1。尿素标准物质为GBW09201，浓度、标准物质不确定度和标准不确定度分别为99.9%，0.2%和0.1%（由国家标准物质研究中心给出）。

（2）天平称量带来的不确定度UB2。天平称量带来的不确定度与称量的不确定度一致。用2点校准法对该不确定度进行确定，在本研究中，所有天平称量皆为对不确定度最大贡献合成，则该工作校准溶液贡献为3次，工作标记物贡献为4次。天平称量不确定度为：

（3）随机因素不确定度 UA。随机因素带来的不确定度由测量结果相对标准偏差表示，具体计算为：

血清中尿素A：

其扩展不确定度为：U=k×uc=0.59%×2≈1.2%

血清中尿素B：

其扩展不确定度为：U=k×uc=0.42%×2≈0.84%

2.4 对比样品定值结果

由上述公式计算结果，确定样品定值结果为：

血清中尿素-水平A：556.45μg/g，不确定度为1.2%，K=2。

血清中尿素-水平B：1123μg/g，不确定度为0.84%，K=2。

3 结论

试验采用13C，15N2-尿素为内标，乙腈为沉淀蛋白， 建立了液相色谱-同位素稀释串联质谱法测定血清中尿素含量。以两种浓度水平的血清样品为指标进行定值，测定盲样中血清含量，分析了盲样测定结果中的不确定度。结果表明，两种水平血清中尿素不确定度分别为1.2%和0.84%，相对标准偏差（RSD）均不大于1%，证实了文章建立的液相色谱-同位素稀释串联质谱法的可靠性。

参考文献

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