利用网络药理学与分子对接技术分析石见穿在治疗癌症中的作用机制

刘利艳 施 旻 陈 力 张 洁 李 斌 温世伟 徐 彭

癌症的发病率和死亡率已经成为第二大威胁人类健康的疾病[1-5]。中医认为“正虚邪实”，“正气亏虚、毒瘀互结” 于脉络是癌症发病的重要因素[6-7]，热毒内蕴可形成肿瘤，即热灼血凝，凝结成块，热灼津液，久积成块等。肿瘤 (癌症)本质是阳化气不足、阴成形积聚[8-10]，癌症自身也可生热成毒[10]，历代医家多以清热解毒、以毒攻毒、化痰散结为主要治法，体现了清热解毒法在癌症治疗中有重要的作用[11]。

石见穿，别名紫参，唇形科植物紫参的全草(Salviae Chinensis Herba)，全草性平、味苦、辛,具有清热利湿、活血调经、解毒消肿之功效，《本草纲目》记载其功效为：主骨痛，大风，痈肿[12-13]。现有文献显示石见穿具有增强免疫力，对胃癌、肠癌、肝癌等多种肿瘤细胞具有良好的抑制作用[13-17]，常与其他中药配伍一起用于癌症的治疗，亦可配合放、化疗，减轻放、化疗患者的不适症状[18-19]。目前对石见穿治疗癌症的作用机制尚不明确。笔者亦未见有关运用网络药理方法对石见穿抗癌作用机制文献报道。基于此，为了进一步研究石见穿的抗肿瘤作用机制，以石见穿为研究对象，采用生物信息数据库以人类蛋白靶标为研究对象进行网络药理学的研究，以探究石见穿在治疗癌症的作用靶标及其作用机制。

1 资料与方法

1.1 数据库及软件

本研究所涉及的数据库有:中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、化合物查询数据库PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、靶点预测数据库swisstargetprediction(http://www.swisstargetprediction.ch/index.php)、疾病靶点数据DisGeNET(http://disgenet.org)和Genecards(https://www.genecards.org)、数据交集数据库Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)、String蛋白相互作用网络平台(https://string-db.org/cgi/input.pl)。通路查询数据库KEGG(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)、蛋白数据库PDB(http://www.rcsb.org)、swissmodel(https://swissmodel.expasy.org)；图形可视化数据库有：RAWGraphs(https://app.rawgraphs.io)；所涉及的软件有：网络可视化Cytoscape3.7.1，R语言，通路富集与生物学分析ClueGo2.5.4和CluePedia、分子对接软件DISCOVERY STUDIO软件等。

1.2 石见穿活性成分及靶点筛选

在TCMSP数据库中搜集石见穿所有的活性成分；若根据化合物的类药性(drug-likeness，DL)≥0.18 和口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%为筛选条件，则符合条件的只有2个化合物，故本研究对活性成分的选择不设筛选条件，将所有活性成分全部纳入研究[20-24]。将纳入活性成分分别在PubChem、swisstargetprediction数据库中检索，筛选物种为“homo sapiens”的靶点，并对各活性成分作用靶点进行筛选(筛选条件为Probability≥0.05)，即为石见穿的预测作用靶点。

1.3 疾病靶点筛选

在DisGeNET和Genecards数据库，以关键词“Cancer”进行检索，筛选条件分别为:Score_gda≥0.05(DisGeNET)，Relevance score≥10(Genecards)，并将石见穿活性成分预测靶点与癌症疾病靶点进行交集，得到共同的靶基因，绘制韦恩图。

1.4 药物-活性成分-靶点网络的构建

将药物与活性成分-靶点(共同靶基因)数据导入Cytoscape中，绘制药物-成分-靶点网络图。

1.5 PPI网络的建立

将交集后的靶基因上传到String数据库，将研究物种为选择为人类(Homo sapiens) ，获取蛋白相互作用数据，结果以TSV格式导出，然后导至Cytoscape软件优化构建和分析蛋白相互作用网络(PPI)，节点大小和颜色均按“degree”排列，edge粗细和颜色均按“combined_score”排列。

1.6 癌症靶点生物学功能分析和通路分析

将共同靶基因经R语言包进行GO、KEGG分析，对石见穿治疗癌症作用的潜在靶点进行生物学功能和通路分析。将Cutoff值设为“p value<0.05”，“q value<0.01”，得到生物功能富集气泡图和barplot图。将得到的与癌症相关通路和靶基因上传至RAW数据库中，构建石见穿-活性成分-靶基因-信号通路的网络图。

1.7 活性成分与关键靶点的分子对接验证

选择靶点数目最多的活性成分作为配体，PPI 网络中“degree”最大的靶点作为受体，进行分子对接。在PDB、swissmodel数据库下载所需蛋白结构，与pubchem下载的三维结构配体一一对接，LibDock对接模式，选择评分分值最高的分子-蛋白对接图(LibDockScore>100，则构象予以保留)。

2 结果

2.1 石见穿活性成分以及靶点筛选

经TCMSP检索，共检索出16个活性成分。将所有的活性成分在swisstarget prediction中检索预测靶点，得到254个预测靶点。

2.2 疾病靶点筛选

分别从DisGeNET和Genecards数据库中获取癌症相关的疾病靶点4511个和1521个，与245个预测靶基因一起输入Draw Venn Diagram进行交集后，得到共同靶基因84个，即为石见穿的潜在作用靶点。见图1。

图1 预测靶点与疾病靶点交集韦恩图

2.3 药物-活性成分-靶点网络的构建

将药物与活性成分靶点(共同靶基因)数据导入Cytoscape中，绘制中药-成分-靶点网络可视图(图2)，圈中心为石见穿，内圈16个节点代表石见穿的16个活性成分，中圈和外圈均为活性成分的作用靶点。体现了石见穿治疗癌症多成分、多靶点协同作用的特点。连接度为前3的潜在活性成分分别为MOL002049(Ferulaldehyde，degree：39)、MOL000263(oleanolic acid，degree：26)和MOL000511(ursolic acid，degree：26)。

图2 石见穿-活性成分-预测靶点相互作用

2.4 PPI网络的建立

将石见穿-癌症84个潜在的靶基因上传至String数据库平台获取的蛋白质相互作用关系数据导至Cytoscape软件优化构建和分析蛋白相互作用网络(PPI)；PPI网络共有84个节点(共同靶基因)通过877条边发生作用，平均节点degree为20.9，可视图中节点越大(半径)则说明其degree越大，edge边越粗，则说明其combined_score 值越大，关联性越好(图3)。经Cytoscape Network分析后得到各靶点的degree值，按照degree从大到小排序，排名前三分别为IL6(57)、MAPK3(56)、EGFR(56)。

图3 石见穿治疗癌症潜在作用靶点PPI网络

2.5 GO功能分析

经R语言包运行后，得到GO富集结果显示：与核受体活性相关的基因有11个、转录因子活性相关的基因有11个、与辅因子结合相关的基因有15个、RNA聚合酶II近端启动子序列特异性DNA结合相关的基因有14个、近端启动子序列特异性DNA结合相关的基因有14蛋白质异二聚活性相关的基因有11个等，靶基因参与这些生物学功能的过程，说明其在生物学行为上占据重要的地位。

2.6 KEGG通路分析

经R语言包运行KEGG后，共得到137条信号通路，其中涉及癌症的通路有24条，感染类的通路有27条，炎症通路的有5条，免疫方面的通路有7条，激素相关通路7条等。IL-6、MAPK3、STAT3、MMP3、GSK3B、PTPRC等基因作为cross-talk 基因参与到 2 条及以上通路中，这些通路和基因涉及癌症发生发展如细胞的增殖、凋亡、转移、血管新生等重要的生物过程。

2.7 活性成分与关键靶点的分子对接验证

选取连接靶点最多的活性成分(前三)，分别为阿魏醛(MOL002049，Ferulaldehyde)、齐墩果酸(MOL000263，oleanolic acid)、熊果酸(MOL000511，ursolic acid)为配体，作用最紧密的蛋白分别为IL6、MAPK3、EGFR三个蛋白为受体。分子对接结果显示(如表1)，IL-6能与石见穿中活性成分阿魏醛稳定结合，通过与氨基酸残端主要与SER L52、ARG H99、ARG H33 氢键连接，ALA H100 烷基连接，GLY L36 Pi-碳氢键，ASP L93、ASP H106 Pi-阴离子方式连接。齐墩果酸能与MAPK3、EGFR稳定结合，分别通过LEU B124 、MET B125、LEU B173、ILF B48、VAL B56、TYR B53 PI烷基或烷基、GLU B50 氢键、GLY B49碳氢键；ALA A289、SERA291、THR A339碳氢键、GLY A288范德华力、VAL A312、CYS A309、CYS A305、ARG A310、TYR A292 PI-烷基连接。熊果酸与MAPK3、EGFR亦能稳定结合，分别通过GLY B49碳氢键、VALB56、TYRB53、LEUB124、ILEB48、CYSB183、METB125、LEUB173PI烷基或烷基连接；LYSA375 烷基、ARGA310碳氢键连接。从对接构象上看，齐墩果酸和熊果酸与MAPK3、EGFR连接构象相似，但其与氨基酸残基连接方式不同。

表1 药物活性成分与蛋白对接情况表

3 讨论

本研究运用网络药理学和分子对接技术的方法对石见穿的治疗癌症作用机制进行研究，从TCMSP数据库中获取了石见穿16个活性成分，通过对化合物靶点网络分析和分子对接等可发现阿魏醛(Ferulaldehyde)、齐墩果酸(oleanolic acid)和熊果酸(ursolic acid)可能是石见穿发挥作用的重要活性成分。通过String数据库发现IL6、MAPK3、EGFR、MAPK1、CASP3、TNF、 PTGS2、ESR1、MAPK8、STAT3等基因为核心靶点。MAPK是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者，能被不同的细胞外刺激，如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。调节着细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的细胞生理/病理过程。IL-6为由基质细胞、上皮细胞等多种细胞产生的1种多功能的细胞因子、在肿瘤、炎症和免疫性疾病中发挥重要作用[25-26]，EGFR是1种受体型酪氨酸激酶。是成红细胞增多症癌基因B(ErbB)家族的主要成员，在许多组织中表达，并参与多种细胞过程，对细胞的生长发育至关重要[27]。研究显示熊果酸能通过抑制(MAPK)/ERK信号通路，来抑制转移性恶性黑色素瘤细胞的增殖，另有报道显示熊果酸能够通过抑制MAPK、EGFR磷酸化，从而抑制EGF刺激结肠癌细胞HT-29的增殖。其能抑制VEGF，参与血管新生。从而抑制肿瘤血管生成[28-30]。经齐墩果酸药物处理后，神经胶质瘤细胞中的MAPK/ERK途径被大大抑制。重组慢病毒载体Lv-MEK诱导的MAPK/ERK激活能够挽救齐墩果酸对神经胶质瘤细胞迁移和侵袭的抑制作用，这说明齐墩果酸是通过抑制MAPK/ERK途径来抑制神经胶质瘤细胞迁移和侵袭[31]。另有研究显示齐墩果酸可有效抑制HU-VEC中VEGF诱导的VEGFR-2活化和血管生成，从而产生抗血管生成作用[32]。上述文献报道与我们的研究结果基本一致。然目前尚未查到有关阿魏醛在肿瘤中、以及通过与IL-6之间相互作用的报道，通过我们本次研究或许能为我们之后探讨阿魏醛在肿瘤中的作用的研究方向提供思路。

综上所述，运用网络药理学来探讨石见穿的治疗癌症潜在作用靶点，通过分子对接技术初步验证了石见穿主要活性成分与潜在的作用靶点发生的相互作用，进一步确定了石见穿治疗癌症是“多成分-多靶点-多通路”的共同作用，为后续深入研究石见穿治疗癌症的分子机制奠定理论基础。