生物纳米材料透射电镜样品制备条件研究

2021-11-01厉艳君吴立敏郝玉红

实验室研究与探索 2021年9期

厉艳君，吴立敏，周莹，陈鹰，郝玉红

（上海市计量测试技术研究院，上海 201203）

0 引言

作为微观结构的一种重要分析表征手段，透射电子显微技术（TEM）以其超高的分辨能力和直观性广泛应用于材料、医学、生物和地质科学等研究领域，具有不可取代的地位［1-4］。对于蛋白、胶束、脂质体等生物纳米材料，由于其主要组成元素是C、H、N、O等，这些元素原子序数低，散射电子能力较弱，与作为背景的碳支持膜之间衬度差异很小，导致其信噪比较低，拍出来的照片对比度小，而且样品易受辐照损伤，难以直接用电镜观测。通常要用染色的方法来增加图像的衬度。

负染色技术最早于1959 年由Brenner 等提出［5-6］。与传统的正染不同的是，样品进行负染时，样品与染液之间不发生反应，故样品本身并不着色。利用样品与染色剂密度的悬殊对比，在电子致密的黑色背景中能反衬出低电子密度的白色样品，形成负反差，故称其为负染色［7］。负染色技术具有操作简单、快速方便，可较好的保存样品结构，使被染样品反差适中、分辨率高，且样品与染液用量少等优点，被广泛应用于病毒、蛋白质晶体、高分子聚合物等的分析［8］，是一项十分重要的实验技术。但是，由于染色效果与染色剂的成分、浓度、pH值、染色方式、染液用量、染色时间等息息相关，染色效果具有一定的随机性，常常需要多次尝试才能获得理想的染色效果。为了达到更好的实验效果，不断有人就电子染色的方法进行研究和改进［9-14］。

在提高染色效果的同时，还有通过适当的方法，不用染色，直接观测到样品。如周剑锋等［15］提出了一种无需染色的“负像法”表征聚丙烯酸酯类乳胶的方法。该方法基于丙烯酸酯类聚合物热黏、冷脆的结构特性，通过短时烘烤，直接获得了样品类似负染效果的电镜图片，方便、快捷，同时避免了负染过程中可能引入的假象。Kraft等［16］采用金胶体修饰样品表面，通过观察金勾勒出的轮廓，直接观察到脂肪酸微凝胶的形貌。王素丽［17］利用计算机算法，减少图像中噪声的影响，增强反差，提高图像的衬度。另外，新的电镜技术冷冻电镜技术（Cryo-EM），可以将样品包埋在玻璃态冰中，观察到亲水生物材料在近乎自然状态下的形貌，减少了染色过程中引入的假象。

本文从调节染色条件的最常见的染液选择、碳支持膜的处理、样品浓度、染色时间出发，研究不同条件下可能出现的一些现象，从而有针对性地调节染色条件，为有效利用TEM 表征生物纳米材料提供参考依据，得到更真实可靠、满足分析要求的高质量照片。

1 实验部分

1.1 试剂与设备

试剂：脂质体（Drmercola），磷钨酸（北京中镜科仪），醋酸双氧铀（Electron Microscopy Sciences）。

仪器：辉光放电仪（ELCO easiGlowTMGlow Discharge，Ted Pella，USA），场发射透射电子显微镜（TECNAI G2，FEI，USA）。

1.2 实验方法

脂质体分散液的配制：称取1 g脂质体，加入9 mL双蒸水后，超声20 min 使充分分散，用滤膜过滤后待用。

醋酸双氧铀染液的配制：称取1 g醋酸铀晶体，加入99 mL双蒸水后，在黑暗中放置30 min，充分溶解后用滤膜过滤，得到1%的醋酸铀水溶液，放在棕色瓶中待用。

负染操作的主要步骤如图1 所示。将适合浓度的脂质体样品溶液滴在碳支持膜上，停留一段时间后用滤纸将多余溶液吸除，再滴加去离子水洗漂洗，用滤纸吸干，并迅速滴上染液，使染液与支持膜上的样品颗粒充分接触，然后用滤纸将多余染液吸除，将样品室温干燥待用。

图1 负染基本流程图

2 实验结果与讨论

2.1 不同染液对染色的影响

分别用1%浓度的醋酸双氧铀和磷钨酸对脂质体进行染色，寻找合适的区域拍照，得到结果如图2 所示。用醋酸双氧铀与磷钨酸染色都可以在样品上找到背景为黑色，颗粒为白色的区域，颗粒轮廓清晰，反差明显，两种染液都能获得较好的染色效果。磷钨酸染色的样品，碳膜上染色区域染液沉积厚度过渡较平缓，碳膜完整；用醋酸双氧铀染色的样品，染色区域较多，对比度较明显，但碳支持膜易破裂。醋酸双氧铀溶液见光易分解［18］，不易保存，需要现用现配，具有一定的放射性和毒性，且试剂价格昂贵。磷钨酸染液配制简便，易于存储。在染色效果差不多的情况下，采用磷钨酸溶液进行染色。

图2 不同染液染色后的TEM图

2.2 碳膜处理方式对染色的影响

将磷钨酸水溶液直接滴在碳支持膜上，在染色区域可以看到如图3（a）所示的白色颗粒。由图3（a）可见，即使是没有样品的铜网，经过染色，也会出现大量的白色球形颗粒。这些颗粒，可能是染液和碳膜表面接触在碳膜上形成的纳米气泡。研究表明，在固液界面之间，有纳米气泡存在［19-21］且纳米气泡主要在疏水表面富集。长时间放置在空气中的碳支持膜，就是一个光滑的疏水表面，当磷钨酸水溶液滴在上面时，在碳-水界面上很可能聚集一些纳米气泡，即图3（a）所观察到的白色颗粒。这种白色球形颗粒，与很多生物纳米材料经染色后的形貌非常相似，极易与样品混淆，在实际应用中应尽量避免。把碳支持膜放入辉光放电仪放电30 s后，再滴加磷钨酸水溶液，观察铜网，可以看到染色区域中的白色颗粒大大减少，如图3（b）所示。该结果说明，增加碳支持膜的亲水性，可以减少这种假象的产生。在碳支持膜上先滴一滴乙醇溶液润湿，再滴加磷钨酸水溶液进行染色，电镜观察发现，染色区域白色颗粒也明显减少，如图3（c）所示。用辉光放电或者乙醇润湿，都能增加碳膜的亲水性，减少在纳米气泡在碳膜表面的聚集，从而减少在染色过程中出现白色球形颗粒。因此，滴加样品前，最好对碳支持膜进行亲水化处理，避免一些因为界面气泡而产生的假象。同时，对于分散在水溶液中的纳米生物材料样品，碳膜亲水化处理也能帮助样品更均匀地分散在支持膜上。

图3 不同碳膜处理方式染色后的TEM图

2.3 样品浓度对染色的影响

将浓度为1%的维C脂质体分散液滴在碳支持膜上，用磷钨酸染色后，形貌如图4（a）所示，样品形貌非常杂乱，看不出颗粒的具体形态。可能是样品浓度过高，颗粒难以有效分散，在碳膜上团聚堆叠，染液无法与样品充分接触，染色后选择性地显示出部分轮廓线，无法观察到样品的真实形貌。稀释10 倍以后，浓度为0.1%的脂质体分散液染色后形貌如图4（b）所示，样品分散较好，较少发生变形，颗粒轮廓清晰，数量较多，分布适宜，由图像可以分析脂质体的形态、粒径大小及分布状况。稀释100 倍以后，浓度为0.01%的脂质体分散液染色后形貌如图4（c）所示，样品分散好，颗粒轮廓清晰，但是数量很少，一个视野下只能找到几个颗粒，没有代表性。样品过稀，沉积在支持膜上的样品数量过少，无法在一个视野中获得足够数量的颗粒，这就导致实验随机性太高，对形貌与粒径分布分析缺乏代表性和说服力，而且加大电镜拍照寻找颗粒的难度。不同的样品所需要的浓度是不一样的，这与样品颗粒的粒径大小、表面电荷、分散性等都有关系，在实验中针对具体的样品可根据拍摄情况进行相应的调整。

图4 不同浓度样品染色后的TEM图

2.4 染色时间对染色的影响

染色时间过短，在铜网上只能找到很少的染色区域，可供观察的区域很少，染色区域没连续的黑色背景区域，只在颗粒附近有很淡的灰色，染色效果有点类似于“正染”，很多颗粒未显示出来，一个视野中看到的颗粒过少，如图5（a）所示。染色时间过长，染液沉积过厚，碳支持膜多处破裂，可供观察区域也少，且碳膜破裂引起碳膜卷曲，引起颗粒变形，影响观察的真实性，如图5（c）所示。同时，过厚的染液沉积也会模糊颗粒边界，使图片不清晰。适当的染色时间，才能获得合适的染色区域，得到衬度明显，轮廓清晰的电镜图片，如图5（b）所示。