稀土钕掺杂介孔生物玻璃的微球调控实验

刘 雨， 张 英

（1.苏州大学a.纺织与服装工程学院；b.材料与化学化工学部，江苏苏州 215123；2.现代丝绸国家工程实验室，江苏苏州 215123；3.南通家纺产业技术研究院有限公司，江苏南通 226000）

0 引 言

药物的控制释放有利于提高药物疗效，减少用药次数，是生物医用材料领域的研究热点之一［1-3］。与传统的生物玻璃材料相比，介孔生物活性玻璃微球（Mesoporous Bioactive Glass Nanospheres，MBG）具有规整有序的孔道，较高的比表面积，良好的生物活性，在药物传输方面受到广泛关注［4-5］。我国稀土资源丰富，储量居世界之首。稀土是镧系元素的通俗名称，元素包括镧、铈、钕等17 种元素［6］。稀土具有独特的理化性质，在工业及科技领域有广泛应用［7］。在稀土元素中，钕（Nd）元素化学性质较活泼，越来越引起人们的关注。在镁或铝合金中添加少量Nd，可提高合金的耐高温性能和气密性［8］；掺杂Nd 的激光器可代替手术刀用于摘除手术或消毒伤口［9］；农药中适量的Nd元素能促进作物的生长，提高农作物的抗病性［10］。钕铁硼（NdFeB）磁能积高，被称作当代“永磁之王”，以其优异的性能广泛用于电子行业［11-12］。但将Nd 用于MBG的研究尚且比较有限，本实验采用溶胶-凝胶法制备Nd 掺杂介孔生物玻璃（Nd/MBG），研究不同Nd掺杂比对Nd/MBG微球药物控制释放能力及其生物安全性的影响，探讨其在药物载体领域的应用潜力。

1 实验部分

1.1 主要试剂

十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、乙酸乙酯（EA）、正硅酸乙酯（TEOS）、磷酸三乙酯（TEP）、四水硝酸钙（CN）、无水乙醇（EtOH）、氨水（NH3·H2O）、胰酶、高糖培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）。

1.2 样品制备

取1.2 g的CTAB加入EtOH和NH3·H2O中，搅拌溶解后依次加入TEOS、TEP 及不同量的CN 和Nd2O3。反复离心冲洗，60 ℃干燥24 h，650 ℃空气下煅烧3 h，得不同Nd掺杂比的Nd/MBG微球（表1）。

表1 Nd/MBG微球样品的主要成分

1.3 形貌表征

Nd/MBG微球的形貌结构用冷场扫描电子显微镜（SEM，S-4700，日本）和透射电子显微镜（TEM，FEI Tecnai G-20，美国）表征。表面元素、基团变化用X 射线光电子能谱（XPS，XSAM800，美国）及傅里叶变换红外光谱仪（FTIR，Nicolet iS5，美国）进行分析。比表面积、孔径分布和吸-脱附等温曲线用比表面测定仪（BET，ASAP2020（M ＋C），美国）表征。

1.4 矿化能力

称取0.05 g 的Nd/MBG 微球浸泡于50 mL 的模拟生理体液（SBF）［13］，37 ℃恒温水浴震荡3 d，丙酮冲洗并干燥，SEM 与FTIR 分析Nd/MBG 表面羟基磷灰石（HA）的矿化能力。

1.5 药物装载

避光条件下，将50 mg Nd/MBG 微球加入到配置好的DOX 溶液中（0.25 mg/mL，6 mL），震荡24 h 后离心收集上清液，得到装载DOX 的Nd/MBG-DOX 微球。紫外可见分光光度计（UV-Vis，CARY50，美国）测定在480 nm吸光度值，计算DOX的装载率：

式中：Wi为DOX的初始量；Wr为未装载DOX的量。

1.6 药物释放

将Nd/MBG-DOX浸泡于7 mL 不同pH 值（pH ＝4.3、7.4、8.6）的PBS 溶液中，恒温水浴震荡，一定时间点取3.5 mL PBS 溶液，UV-Vis 测定吸光度，计算DOX的累积释放量：

式中：Ct为对应时间的DOX 浓度；v 为介质体积3.5 mL；V为体系总体积7 mL。

1.7 细胞毒性

取浓度为1 × 105个/mL的人骨肉瘤细胞（MG63）种植到96 孔板中，加入不同浓度（50、100、200 μg/mL）的Nd/MBG 微球及Nd/MBG-DOX 微球。培养1，3，5 d，CCK-8 试剂盒（CCK-8，Sigma，St.Louis，USA）检测细胞活力［19］，不加材料组为空白对照组。

2 结果与讨论

2.1 Nd/MBG微球的表面形貌表征

从图1（a）TEM 可看出，Nd/MBG 微球为均匀的球形，粒径达到纳米级，表面存在微小的纳米孔隙。不同Nd掺杂量的Nd/MBG微球材料从内到外逐渐变得疏松。EDS 图显示微球中Si、P 和Ca 元素呈均匀分布，Nd 在MBG 中呈现高度分散的均匀分布（图1（b））。XPS结果显示，0 Nd/MBG微球中存在Si特征峰，未见Nd特征峰。掺杂Nd后的Nd/MBG微球中Si元素图形与未掺杂时相似，但元素的结合能变小，电子数变少，价态升高，表明此时的Si 以四价的形式存在的。Nd元素图谱中，980 和1 000 eV 处出现明显的3d 5/2和3d 3/2 的结合能谱峰，表明Nd3＋的存在（见图1（c））。

图1 （a）不同Nd掺杂比的Nd/MBG微球的TEM图；（b）EDS能谱分析1 Nd/MBG微球表面Si、Ca、P和Nd元素分布；（c）0、2 Nd/MBG微球表面Si4 ＋、Nd3 ＋的XPS图谱

吸脱附等温线的形状与材料的结构有关［15］，利用N2吸附-脱附测试检测Nd/MBG微球的孔径及结构变化（见图2）。不同Nd掺杂比的Nd/MBG微球的洗脱等温线均为Langmuir IV型等温线，具有H1 型迟滞回线，表明Nd/MBG微球具有介孔结构。通过BET方程计算，0 Nd/MBG的比表面积（SBET）、平均孔径（DP）和孔体积（VP）分别是400 cm2/g、2.7 nm和0.33 cm3/g，随着Nd掺杂量的增加，微球的SBET略有所减小，但DP略有所增加；1 Nd/MBG 的DP最高到4.5 nm；2 Nd /MBG的SBET、DP和VP分别为177 cm2/g、3.6 nm 和0.22 cm3/g。表明改变Nd 的掺杂量，可以调节Nd /MBG微球的大小及孔径。

图2 Nd/MBG微球的N2 吸附-脱附等温线及孔径分布曲线

2.2 Nd/MBG微球体外生物活性

将不同Nd 掺杂比的Nd/MBG 微球浸泡入SBF中，3 d后SEM和FTIR观察微球表面HA的沉积情况（见图3），考察Nd/MBG微球体外生物活性。结果表明，所有Nd/MBG 微球未浸泡SBF 前，均表现出规则的球形形态，分散均匀，表面存在介孔结构。浸泡3 d后，各组Nd/MBG微球表面均有大量HA 生成。其中0 Nd/MBG微球表面HA 呈无规则的薄片状，掺杂Nd的Nd/MBG微球表面HA 分布更均匀，且呈三维立体花簇状。FTIR结果显示，0 d 时，Nd 掺杂前后的Nd /MBG微球主要特征峰无明显变化，表明Nd 的添加不会对MBG的组成和结构造成明显影响。浸泡3 d后，样品在507 cm－1处出现了明显的强峰，对应HA 中的P—O—基团的特征峰，表明Nd/MBG 微球表面有HA生成，具有生物活性。

图3 在SBF中浸泡0和3 d后Nd/MBG微球SEM和FTIR谱图

2.3 药物的装载释放

阿霉素（Doxorubicin，DOX）是一种蒽环类广谱抗肿瘤药物，具有明显的抑癌作用。但DOX难溶于水且不具有靶向性，体内易被P-糖蛋白外排。如果大量使用药物，可能会引起不良反应［16-17］。实验采用Nd /MBG微球装载DOX，24 h后0 Nd/MBG微球的装载率为86.3%，表明Nd/MBG微球能在短时间内与溶液中的DOX充分接触吸附。增加Nd的掺杂量，DOX装载效率略有所下降，但仍保持在70%左右。表明Nd /MBG微球有良好吸附能力，有利于提高DOX 给药效率，减少因药物过量使用而引起的不良反应（见表4）。

装载DOX的Nd/MBG-DOX微球的释放行为会受到释放环境的影响。不同pH 条件下，Nd/MBG-DOX微球显现出不同的控制释放能力。pH ＝8.6 时，Nd /MBG-DOX微球的最大释放率为36%，最小释放率为13%（见图5（c））；pH ＝7.4 时，最大释放率为39%，最小释放率为15%（见图5（b））；pH ＝4.7 时，最大释放率高达82%，最小释放率为53%（见图5（a））。相同pH条件下，不同Nd 掺杂比的Nd/MBG-DOX 微球DOX累计释放率不同。pH ＝8.6 时，0 Nd/MBG-DOX微球在25 h内释放率达到30%，250 h后到40%。掺杂Nd后释放率降低，其中1 Nd/MBG-DOX 微球累计释放量最低，250 h 后为15%（见图5（c））。pH ＝4.3时，各组掺杂Nd的Nd/MBG-DOX微球在最初25 h内都能快速释放DOX，并随着时间延长显示出良好的控制释放能力。250 h 后，0.5，1，2 Nd/MBG-DOX 累计释放率分别达为70%、60% 和58%（见图5（a））。Higuchi模型计算Nd/MBG-DOX 微球的DOX 累计释放量。相同Nd掺杂比的Nd/MBG-DOX微球，DOX在不同pH环境中的释放量顺序为pH ＝4.3 ＞pH ＝7.4＞pH ＝8.6。相同pH 条件下，DOX 动力学释放速度顺序有所不同。pH ＝8.6 时，0 Nd/MBG-DOX ＞0.5 Nd/MBG-DOX ＞2 Nd/MBG-DOX ＞1 Nd/MBG-DOX；pH ＝7.4 时，0 Nd/MBG-DOX ＞2 Nd/MBG-DOX ＞1 Nd/MBG-DOX ＞0.5 Nd/MBG-DOX；pH ＝3.4 时，0 Nd/MBG-DOX ＞1 Nd/MBG-DOX ＞0.5 Nd/MBG-DOX＞2 Nd/MBG-DOX。表明Nd/MBG-DOX 微球在不同pH值下具有差异化的延迟释放能力，在递送过程中有利于DOX在肿瘤部位的积累，减少耐药现象的发生。

图4 Nd/MBG微球装载DOX的效率

图5 Nd/MBG-DOX 微球在不同pH 溶液中DOX 的累计释放曲线及Higuchi释放模型

2.4 细胞活力

采用CCK-8 试剂盒检测不同浓度的Nd/MBG 和Nd/MBG-DOX微球对MG63 细胞生长的影响。当浓度50 μg/mL，1 d 时各Nd/MBG 微球组的OD 值基本与control组持平，表明Nd/MBG微球能够支持细胞生长。Nd/MBG-DOX组OD值略小于Nd/MBG组，表明Nd/MBG-DOX微球能够释放DOX，影响MG63 细胞的生长。3 d时，各Nd/MBG微球组的OD值较第1 d都有所上升，表明该浓度下细胞生长良好。而Nd/MBGDOX组OD 值低于各Nd/MBG 组，且存在显著性差异。5 d时，Nd/MBG微球组生长趋势与前3 天类似，说明该浓度下Nd/MBG 微球能够支持MG63 细胞生长，细胞毒性小。Nd/MBG-DOX 微球能释放DOX，明显抑制MG63 细胞的增殖（见图6（a））。当浓度为100 μg/mL 时，在培养初期，各Nd/MBG 组对细胞的增殖没有产生明显的影响，表明该浓度下Nd/MBG 微球仍能够支持MG63 细胞生长，细胞毒性较小。Nd /MBG-DOX组细胞生长趋势也与浓度50 μg/mL 时相似，说明Nd/MBG-DOX微球释放的DOX能抑制MG63细胞的增殖。随着培养时间的延长，1 Nd/MBG 微球在第5 d时表现出抑制细胞增殖的情况（见图6（b））。当浓度增加为200 μg/mL 时，Nd/MBG 微球组的OD值较control组明显降低，表明浓度过高的Nd/MBG微球有细胞毒性，不利于细胞生长。5 d 时，各Nd/MBG微球组的OD值较第1 d 略有所上升，但细胞毒性明显。相同条件下，Nd/MBG-DOX 微球能够释放DOX，显著抑制MG63 细胞生长（见图6（c））。研究结果显示当浓度低于100 μg/mL 时，Nd/MBG 微球相对无毒性，是比较安全的载体。Nd/MBG-DOX 微球能够缓慢控制药物释放，起到抑制癌细胞生长的作用。

图6 不同浓度的Nd/MBG 微球和Nd/MBG-DOX 微球对MG63细胞活力的影响（1：空白对照样；2：0Nd/MBG；3：0.5Nd/MBG；4：1Nd/MBG；5：2Nd/MBG；6：0Nd/MBGDOX；7：0.5Nd/MBG-DOX；8：1Nd/MBG-DOX；9：2Nd/MBG-DOX）（a）：50 μg/mL，（b）：100 μg/mL，（c）：200 μg/mL（*：P ＜0.05，**：P ＜0.01）

3 结 语

本实验采用溶胶-凝胶法制备不同Nd 掺杂比的Nd/MBG微球，大小均匀，表面存在微小的纳米孔隙。通过改变Nd 掺杂比，可以调控Nd/MBG 微球的表面形貌特征。其中，1 Nd/MBG 微球具有更大的比表面积、平均孔径和孔体积。Nd/MBG 微球能够体外矿化生成HA，具有生物活性。Nd/MBG 微球能够装载DOX，且在不同pH 环境下表现出差异化的延迟释放能力。相同Nd掺杂比的Nd/MBG-DOX微球，在pH ＝4.3 环境中的累积释放量最大。不同Nd 掺杂比的微球，pH ＝3.4 时，2 Nd/MBG-DOX 的延迟释放能力最强。体外细胞培养结果显示，Nd/MBG 微球对MG63骨肉瘤细胞的生物安全性具有剂量依赖性。当浓度低于100 μg/mL 时，细胞培养时表现出较高的安全性。Nd/MBG-DOX微球能够控制DOX 的释放，在递送过程中有利于DOX在肿瘤部位的积累，减少耐药现象的发生。研究结果表明，通过改变Nd 掺杂比调控制备的Nd/MBG微球，具有良好的药物控释能力和生物安全性，在药物载体领域具有潜在应用价值。