基于网络药理学的泽泻-白术药对治疗血脂异常作用机制研究

2021-11-01赵志滨李李陈欣燕林嬿钊

中国中医药信息杂志 2021年10期

赵志滨，李李，陈欣燕，林嬿钊

赵志滨1，2，李李1，陈欣燕2，林嬿钊2

1.广州中医药大学第二临床医学院，广东广州 510006； 2.省部共建中医湿证国家重点实验室，广州中医药大学第二附属医院，广东广州 510120

基于网络药理学研究泽泻-白术药对治疗血脂异常的活性成分、靶点及通路机制。通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）和文献检索收集泽泻、白术的活性成分，基于TCMSP、SwissTargetPrediction数据库预测相关成分的作用靶点；通过OMIM、DisGeNET、DrugBank数据库获取血脂异常相关靶点；利用STRING数据库构建靶点蛋白相互作用网络，筛选关键靶点；采用DAVID6.8数据库进行GO分析和KEGG通路富集分析，Cytoscape3.8.0构建活性成分-靶点-通路网络，筛选核心活性成分；利用SwissDock数据库对核心活性成分与关键靶点进行分子对接。筛选出泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇A、白术内酯Ⅲ等10个核心活性成分，VEGFA、IL6、EGFR等11个关键靶点，KEGG分析得到影响基础代谢率的HIF-1信号通路，抑制脂肪生成的AMPK信号通路，影响食欲、脂肪代谢的Toll样受体信号通路等103条信号通路（＜0.05）。分子对接结果表明，泽泻-白术药对核心活性成分与治疗血脂异常的关键靶点可紧密结合。泽泻-白术药对的泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇A、白术内酯Ⅲ等活性成分可能通过调控VEGFA、IL6、EGFR等靶点的表达，激活或抑制相关信号通路，发挥抑制食欲、抑制胆固醇转运及合成、抑制脂肪细胞生长等作用，从而治疗血脂异常。

泽泻；白术；血脂异常；高脂血症；网络药理学；分子对接

血脂异常通常指血清中总胆固醇（TC）和/或三酰甘油（TG）水平升高，是心血管疾病重要的危险因素[1]。流行病学调查显示，中国人群血脂水平与血脂异常的患病率逐步升高[2]。防治血脂异常对我国心血管疾病的预防和治疗具有重要意义。现代医学治疗血脂异常以调脂为主，但大多有肝毒性、肌肉毒性等不良反应。中医不仅可降低血脂，还可升高血清高密度脂蛋白（HDL）水平，具有疗效确切、不良反应小等优势[3-4]。

泽泻-白术为泽泻汤、五苓散等健脾祛湿方剂的核心药对，临床多用含有泽泻-白术药对的方剂治疗血脂异常[5-6]，但其分子机制尚不明确。为此，本研究采用网络药理学方法研究泽泻-白术药对治疗血脂异常的活性成分、作用靶点及通路等，进一步明确其作用机制，为后续研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 泽泻-白术药对活性成分及靶点筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）[7]检索“泽泻”“白术”，收集活性成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18为标准进行筛选，并结合相关文献纳入活性成分，校正成分名称。利用PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取活性成分的分子结构，通过TCMSP、SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）预测活性成分的潜在靶点。

1.2 血脂异常疾病靶点检索

以“Hyperlipidemias”“Hypercholesterolemia”“Hypertriglyceridemias”“Heterozygous Familial Hypercholesterolemia”“Homozygous Familial Hypercholesterolemia”“Primary Hyperlipidemia”“Non-familial Hypercholesterolemia”为检索词，通过OMIM（https://omim.org/）、DisGeNET（https://www. disgenet.org/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）数据库获取血脂异常的相关靶点。

1.3 蛋白相互作用网络构建与分析

利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）校正基因靶点名称，将泽泻-白术药对活性成分靶点与血脂异常相关靶点取交集。利用STRING11.0数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl）[8]构建蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，物种选择“Homo sapiens”，最低相互作用阈值选择“high confidence（0.7）”，并隐藏网络中无联系的节点，导出结果通过Cytoscape3.8.0进行可视化处理。根据连接度筛选关键靶点。

1.4 GO分析和KEGG通路富集分析

利用DAVID6.8数据库（https://david.ncifcrf. gov/）[9]，对泽泻-白术药对靶点与血脂异常靶点的交集靶点进行GO和KEGG富集分析，设定阈值为＜0.05。将富集结果按值升序排序，并对GO分析排名前10位的条目及KEGG分析排名前20位的条目进行可视化展示。根据KEGG分析前20位条目包含的靶点及其对应的活性成分，利用Cytoscape3.8.0构建活性成分-靶点-通路网络，进一步筛选核心活性成分。

1.5 分子对接验证

从RSCB PDB数据库（http://www.rcsb.org/）下载关键靶点的蛋白质结构，利用SwissDock服务器（http://www.swissdock.ch/）对核心活性成分的分子结构和关键靶点进行分子对接，根据结合能评价活性成分与靶点的结合强度与活性。

2 结果

2.1 药物活性成分、靶点及疾病靶点

通过TCMSP检索并筛选泽泻、白术活性成分，另基于文献[10-13]纳入泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、苍术酮、双白术内酯，最终获得泽泻活性成分10个、白术活性成分12个，见表1。基于TCMSP、SwissTargetPrediction数据库预测泽泻活性成分靶点271个、白术活性成分靶点248个，去除重复值，共得到潜在靶点405个。检索OMIM、DisGeNET、DrugBank数据库得到血脂异常相关靶点1 767个。

表1 泽泻-白术药对活性成分

药物序号MOL ID活性成分OB/%DLPubChem CID靶点数白术BZ1MOL00002012-千里光酰基-8-反式白术三醇62.400.22 0 BZ2MOL00002114-乙酰基各里光酰基-8-反式白术三醇60.310.31 0 BZ3MOL00002214-乙酰基-12-千里光酰基-8-顺式折术三醇63.370.301329410861 BZ4MOL000028α-香树脂醇39.510.767317058 BZ5MOL000033(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-[(2R,5S)-5-丙烷-2-yloctan-2-yl]- 2,3,4,7,8,9,11,12,14, 15,16,17-十二水-1H-环戊二烯[a]菲酚-3-ol36.230.781597610143 BZ6MOL0000493β-乙酰氧基苍术酮54.070.22 16 BZ7MOL0000728β-乙氧基苍术内酯-Ⅲ35.950.211444807541 BZ8MOL000043白术内酯Ⅰ37.370.15532101838 BZ9MOL000044白术内酯Ⅱ47.500.151444807053 BZ10MOL000045白术内酯Ⅲ68.110.1715594838 BZ11MOL000046苍术酮41.100.13308063518 BZ12MOL000062双白术内酯17.450.8110813930101 泽泻ZX1MOL000359谷甾醇36.910.751230364549 ZX2MOL000830泽泻醇B34.470.8215558620100 ZX3MOL00083223-乙酰泽泻醇B32.520.821403681150 ZX4MOL00084916β-甲氧基泽泻醇B乙酸酯32.430.77 1 ZX5MOL000854泽泻醇C32.700.8246173914100 ZX6MOL00085623-乙酰泽泻醇C33.060.831403681378 ZX7MOL002464单亚油酸甘油酯37.180.30643663059 ZX8MOL000828泽泻醇A18.280.8115558616100 ZX9MOL00082923-乙酰泽泻醇A24.210.8070690607100 ZX10MOL00085124-乙酰泽泻醇A24.210.8076336194100

2.2 交集靶点蛋白相互作用网络

将泽泻-白术药对潜在靶点与血脂异常相关靶点取交集，获得交集靶点102个。将交集靶点导入STRING11.0数据库，并利用Cytoscape3.8.0进行可视化处理，结果见图1。该网络包含88个节点和264条边，平均连接度为6。节点连接度越大表明其在PPI网络中越重要，按连接度降序排序，二次取平均值，连接度≥13的靶点见表2。这些靶点可能是泽泻-白术药对治疗血脂异常的关键靶点。

2.3 GO分析和KEGG通路富集分析结果

对泽泻-白术药对潜在靶点与血脂异常相关靶点的交集靶点进行GO及KEGG富集分析，以＜0.05为条件筛选。GO分析得到227条生物过程（BP）、35条细胞组分（CC）、64条分子功能（MF）条目，各选取前10条进行可视化展示，见图2。可以看出，泽泻-白术药对治疗血脂异常的生物过程主要富集在ERK1和ERK2级联的正调控（positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade）、MAPK活性的激活（activation of MAPK activity）、磷脂酰肌醇3-激酶信号的调节（regulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling）、MAPK级联的正调控（positive regulation of MAPK cascade）、类固醇激素介导的信号通路（steroid hormone mediated signaling pathway）等。

注：圆形大小和颜色深浅代表连接度（degree），连线粗细代表结合度（combined score）

表2 泽泻-白术药对治疗血脂异常PPI网络核心靶点拓扑参数

基因名靶点名连接度介度紧密度 VEGFA血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A）230.108 404 3520.476 470 588 IL6白细胞介素-6（interleukin-6）220.110 960 5120.485 029 940 PIK3CA磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α亚型（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform）210.082 576 1820.437 837 838 MAPK1丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1）200.077 801 8520.457 627 119 EGFR表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor）200.208 817 7410.490 909 091 TNF肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor）190.077 354 0780.465 517 241 APP淀粉样β蛋白A4蛋白（amyloid-beta A4 protein）170.169 028 3950.433 155 080 CXCL8白细胞介素-8（interleukin-8）150.028 436 0010.415 384 615 MAPK3丝裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3）150.059 477 6450.442 622 951 IL1B白细胞介素-1β（interleukin-1 beta）130.047 961 5570.413 265 306 MTOR雷帕霉素靶蛋白（serine/threonine-protein kinase mTOR）130.064 728 1410.428 571 429

KEGG通路富集分析共得到103条通路，对前20条通路进行可视化展示，结果见图3。可以看出，泽泻-白术药对治疗血脂异常的通路主要包括HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、胰岛素抵抗（Insulin resistance）、AMPK信号通路（AMPK signaling pathway）、VEGF信号通路（VEGF signaling pathway）、Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）等。

图3 泽泻-白术药对与血脂异常交集靶点KEGG分析

2.4 活性成分-靶点-通路网络

将前20条KEGG通路包含的靶点及其对应活性成分利用Cytoscape3.8.0构建活性成分-靶点-通路网络，结果见图4。该网络有78个节点、418条边，其中泽泻、白术活性成分各9个。将关联的活性成分按连接度排序，前10位活性成分见表3。

表3 泽泻-白术药对核心活性成分拓扑参数（前10位）

序号核心活性成分连接度介度紧密度 ZX923-乙酰泽泻醇A170.033 714 6600.475 308 642 ZX8泽泻醇A160.039 329 9940.469 512 195 ZX1024-乙酰泽泻醇A150.033 578 3900.463 855 422 ZX2泽泻醇B140.025 371 2110.458 333 333 ZX5泽泻醇C130.023 029 9780.452 941 176 ZX623-乙酰泽泻醇C100.017 827 2130.437 500 000 BZ4α-香树脂醇100.023 726 1730.437 500 000 ZX7单亚油酸甘油酯 90.007 748 3660.432 584 270 ZX1谷甾醇 80.006 836 1760.377 450 980 BZ10白术内酯Ⅲ 80.019 289 7120.423 076 923

2.5 分子对接结果

将核心活性成分与关键靶点进行分子对接验证。结合能越小代表蛋白质与分子结合越紧密，结合能＜0表示分子与蛋白存在结合能力，结合能≤-7 kcal/mol表示分子与蛋白的结合活性较紧密。分子对接显示，结合能＜0的有116种（100%），结合能≤-7 kcal/mol的有102种（87.9%），表明泽泻-白术药对核心活性成分与关键靶点结合较为紧密。其中泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A等三萜类成分及单亚油酸甘油酯、α-香树脂醇、谷甾醇与关键靶点的结合活性较为显著（结合能≤-9 kcal/mol），见图5。

图5 泽泻-白术药对核心活性成分与靶点分子对接结果

3 讨论

血脂异常最常见的临床证候为痰浊阻滞[14]，属于湿证范畴。泽泻-白术药对可健脾祛湿，是临床治疗血脂异常的常用药对。泽泻味甘性寒，《神农本草经》载其“养五脏，益气力……不饥，延年轻身”；白术性味苦温，《名医别录》载其“消痰水，逐皮间风水结肿……暖胃，消谷嗜食”。实验研究表明，泽泻-白术药对具有明确的降血脂作用[15]。

本研究通过网络药理学方法筛选出泽泻-白术药对治疗血脂异常的核心活性成分为泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇B、α-香树脂醇、白术内酯Ⅲ等。泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C等三萜类成分有良好的降血脂作用[16]，且在泽泻中含量丰富，是定性鉴别泽泻的标志性成分[10]。谷甾醇在泽泻醇提取物中含量较高（85 mg/100 g）[17]。白术内酯Ⅲ等倍半萜类化合物在白术中含量较高，且药效、药性等与白术相符，为其质量标志物[12]。

研究显示，泽泻醇A可降低小鼠小肠TC吸收率，并抑制小肠酯化TC的能力，从而发挥降脂作用[18]。23-乙酰泽泻醇A具有剂量依赖性的激活法尼醇X受体（FXR）作用，可促进磷脂向HDL转运，进而降低体内TC水平[19]。施凤飞等[20]研究表明，24-乙酰泽泻醇A可通过调节巨噬细胞脂代谢因子ATP结合盒转运体A1（ABCA1）、B族清道夫受体，促进TC从细胞内转运至肝脏分解。Prabhakar等[21]研究显示，高果糖饮食小鼠的血浆葡萄糖、TC和TG水平明显升高，HDL水平下降，并出现肝氧化应激损伤，而α-香树脂醇可抑制以上变化，并保护过氧化物酶体增殖剂激活受体α亚型（PPAR-α）蛋白水平。PPAR-α具有降低TG、升高HDL、抗炎等作用[22]，这可能是α-香树脂醇降脂的作用机制。单亚油酸甘油酯不仅可抑制载脂蛋白CⅢ（apo CⅢ）表达以抑制机体对胆固醇的转运、吸收，还可抑制脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）的表达[23]，从而减少游离脂肪酸的生成。谷甾醇可在肠腔内通过竞争性结合降低肠道对TC的摄入，并降低血浆低密度脂蛋白（LDL）浓度，从而发挥降血脂作用[24]。白术内酯Ⅲ可上调过氧化物酶体增殖剂激活受体共激活因子-1α（PGC-1α）及线粒体相关受体的表达，增强小鼠骨骼肌细胞的AMPK磷酸化，提高骨骼肌代谢，达到降脂、降糖的作用[25]。

PPI网络分析显示，泽泻-白术药对治疗血脂异常的关键靶点为VEGFA、IL6、EGFR、TNF、IL1B、MAPK1、MAPK3等。白术内酯Ⅰ可下调细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达[26]，VEGFA作为其亚型之一，表达下调可以抑制脂肪组织的血管生成[27]，从而减少脂肪组织生成。EGFR参与调节脂质代谢，对脂肪再生和胆固醇合成起重要作用[28]，并可加剧血管组织氧化应激反应、巨噬细胞浸润等，导致动脉粥样硬化[29]。IL6、TNF、IL1B、CXCL8等靶点与炎症反应相关。炎症反应可刺激脂肪细胞的氧化应激反应，影响其增殖分化、细胞因子分泌及对胰岛素敏感性等生物学过程，进而导致血脂异常和脂肪进一步蓄积[30]。实验研究表明，泽泻提取物及白术内酯均能显著下调白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α等炎症因子表达，具有良好抗炎活性[31-32]。MAPK1、MAPK3是MAPK信号通路的重要组成部分，MAPK信号通路与调控血脂相关[33]。研究发现，以泽泻、白术为君药的茵陈五苓散可激活MAPK，通过MAPK相关级联反应抑制LDL受体的表达，进而降低血脂水平[34]。分子对接结果显示，泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A等三萜类成分及单亚油酸甘油酯、α-香树脂醇、谷甾醇与关键靶点的结合活性较佳。因此，泽泻-白术药对通过调节以上关键靶点发挥降脂、抑制脂肪细胞生长、防治动脉粥样硬化的作用可能性较大。

GO分析结果显示，泽泻-白术药对治疗血脂异常的生物过程主要富集在ERK1和ERK2级联的正调控、MAPK级联的正调控、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号的调节、类固醇激素介导的信号通路等。ERK1/2级联的正调控能够增加ABCA1表达[35]，进而增强机体对TC的排泄能力。白术提取物可以上调细胞对ERK1/2的表达[36]，24-乙酰泽泻醇A可激活ERK通路，下调其下游过氧化物酶体增殖剂激活受体γ亚型（PPAR-γ）、脂滴包被蛋白（perilipin A）的表达，诱导脂肪酶分解脂肪[37]。PI3K信号通路参与下丘脑瘦素信号的调节[38]，可调节食欲与脂质代谢过程。类固醇激素包括性激素和皮质激素，其介导的信号通路在生命活动中起到广泛且重要的作用。其中雄激素能显著上调血清瘦素和血清脂联素水平，进而减少皮下和内脏脂肪量。雌激素对女性体内的能量代谢起到重要作用，缺乏雌激素的围绝经期女性易出现血脂异常及肥胖。有报道，23-乙酰泽泻醇B可通过上调雌激素受体α的表达，降低血清TC、TG水平[39]；白术挥发油可上调雌二醇表达，有类激素作用[40]。由此可以推测，泽泻-白术药对通过多个信号通路参与以上生物学过程，从而发挥调控血脂的作用。

KEGG分析结果显示，泽泻-白术药对治疗血脂异常的主要通路有HIF-1信号通路、AMPK信号通路、VEGF信号通路、Toll样受体（TLR）信号通路等。Gaspar等[41]研究发现，高脂饮食会激活HIF-1信号通路，促进下丘脑缺氧诱导因子-1的表达以增加基础代谢率，控制体质量，并改善高脂带来的炎症反应、糖耐量受损等负面影响。AMP活化蛋白激酶（AMPK）是调节人体组织能量代谢的重要因子。研究发现，脂肪组织中的AMPK具有调节脂肪细胞褐变和维持能量稳态的重要作用，能够缓解高脂饮食引起的糖耐量受损、体质量增加，并抑制白色脂肪细胞生长[42]。实验研究显示，24-乙酰泽泻醇A可上调3T3-L1脂肪细胞内PPARα、PGC-1α的表达，激活AMPK通路，抑制Perilipin的磷酸化，进而降低游离脂肪酸水平和脂肪细胞的脂质积累[37]。泽泻醇A可激活AMPK/ACC信号通路，改善血脂异常，并促进肝脏的脂肪代谢[43]。白术内酯可激活AMPK通路，对血脂异常的治疗产生积极作用[25，44]。TLR信号通路参与多种生物学过程，包括食欲、炎症反应等。研究显示，TLR4基因敲除小鼠对高脂、高糖饮食偏好降低[45]，表明TLR4可通过增加对高脂高糖饮食的食欲促进脂肪和糖的摄入。脂肪组织增生常伴随着促炎巨噬细胞的作用，TLR4是其中重要的炎症因子，可以抑制脂肪褐变、分解[46]，从而加剧脂肪积累。实验研究表明，白术内酯Ⅰ能有效拮抗TLR4，抑制TLR4/NF-κB信号通路[47]。以泽泻-白术药对为主组方的加味泽泻汤能下调TLR4等TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白的表达，改善肝脏的炎症反应[48]。血脂异常与胰岛素抵抗有密切关系，若机体出现胰岛素抵抗，将抑制脂肪组织的代谢，导致脂肪蓄积，加剧血脂异常。本研究发现泽泻-白术药对可通过胰岛素抵抗通路治疗血脂异常，提示泽泻-白术药对具有治疗糖尿病的潜在价值。

综上所述，泽泻-白术药对通过多靶点、多通路起到调节血脂异常的作用。本研究可为临床使用泽泻-白术药对治疗血脂异常提供一定依据，但仍有以下不足：①由于数据库的局限性，本研究未能纳入泽泻-白术药对所有的活性成分；②未能考虑活性成分在人体的药代动力学及代谢前后的化学变化；③中药具有双向性，如泽泻醇、白术内酯可通过抑制ERK1/2通路起到抗炎作用，这与相关成分激活ERK1/2通路调控血脂不同，泽泻-白术药对在ERK1/2级联中的具体作用有待进一步研究。

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Study on Mechanism of Medicinal Pair of Alismatis Rhizoma-Atractylodis Macrocephalae Rhizoma in Treatment of Dyslipidemia Based on Network Pharmacology

ZHAO Zhibin1,2, LI Li1, CHEN Xinyan2, LIN Yanzhao2

To analyze the active components, targets and pathway mechanism of medicinal pair of Alismatis Rhizoma-Atractylodis Macrocephalae Rhizoma in the treatment of dyslipidemia based on network pharmacology.TCMSP and literature were used to retrieve the active components of Alismatis Rhizoma and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma; TCMSP and SwissTargetPrediction databases were used to predict the targets. OMIM, DisGeNET, and DrugBank databases were used to obtain dyslipidemia-related targets. STRING database was used to construct target PPI network and screen key targets. DAVID 6.8 database was used for GO analysis and KEGG analysis, and Cytoscape 3.8.0 was used to construct an active component-target-pathway network to screen core active components. The SwissDock database was used for molecular docking of core active components and key targets.Totally 10 core active components, such as alisol A, alisol A 23-acetate, atractylenolide Ⅲ were screened out. 11 key targets, such as VEGFA, IL6 and EGFR were screened out. KEGG analysis obtained 103 signal pathways including the HIF-1 signaling pathway that affects the basal metabolic rate, the AMPK signaling pathway that inhibits adipogenesis, and the Toll-like receptor signaling pathway that affects appetite and fat metabolism (<0.05). The molecular docking results showed that the core active components of the medicinal pair of Alisma Rhizoma-Atractylodis Macrocephalae Rhizoma could be closely combined with the key target for the treatment of dyslipidemia.The active components in the medicinal pair of Alismatis Rhizoma-Atractylodis Macrocephalae Rhizoma, such as alisol A, alisol A 23-acetate, atractylenolide Ⅲ may through regulating the expression of the protein targets to treat dyslipidemia, like VEGFA, IL6, EGFR, TNF, IL1B, and MAPK1, to activate or inhibit the relevant signaling pathways, so as to play the role of inhibiting appetite, inhibiting cholesterol transport and synthesis, inhibiting the growth of adipocytes and other functions to treat dyslipidemia.

Alismatis Rhizoma; Atractylodis Macrocephalae Rhizoma; dyslipidemia; hyperlipidemia; network pharmacology; molecular docking

R259.892；R285

1005-5304(2021)10-0037-08

10.19879/j.cnki.1005-5304.202101456