小檗碱对膀胱癌T24细胞增殖、迁移的影响及分子机制研究

许真俊，王 忠，唐锁艳，丁 康，沈 玲

(1.扬州洪泉医院泌尿外科，江苏 扬州 225200；2.扬州洪泉医院药剂科，江苏 扬州 225200；3.南京中医药大学附属南京中医院，江苏 南京 210001；4.扬州市江都区第二人民医院药剂科，江苏 扬州 225200)

膀胱癌(Bladder Cancer，BC)为当前泌尿系统中最为常见的一种恶性肿瘤，全球范围内其发病率和死亡率分别排名恶性肿瘤第九位及第十位[1].虽然此类患者中约有75%为非肌层浸润性膀胱癌，给予规范科学的手术治疗能够提高预后质量，延长生存时间，然而其中约有25%属于肌层浸润性膀胱癌，这部分患者在治疗后容易发生转移[2].目前，化学治疗依然是膀胱癌的主要治疗工具.但是，化疗引起的严重不良反应导致患者依从性差，同时不可避免会出现耐药性.因此，寻找新的治疗膀胱癌药物对于防治该疾病尤为迫切.

膀胱癌属于“癃闭”、“血淋”、“尿血”等范畴，考虑到患者术后及化疗后体质虚弱，免疫力下降，黄连等民族药物通过扶正、兼顾温补肾阳，化气行水作用而改善膀胱癌患者预后疗效.在具体应用中，相关民族药物因其疗效确切、成本不高、安全可靠等优势，在防治膀胱癌等肿瘤领域受到重视，故研究其药效物质基础具有重要的理论意义及现实价值.

小檗碱也称之为黄连素，是从民族药物黄连中提取的一种代表性生物碱类化合物[4].现代研究指出，其具有显著的抗肿瘤、抗氧化、消炎、降脂、降糖等作用[5-7].众多研究发现，小檗碱在结直肠癌、乳腺癌、肝癌等其它一些肿瘤的研究中均表现出高效的抗肿瘤活性[8-11].VEGFA、PI3K等蛋白靶点以及增殖、迁移等表型均是肿瘤研究中的常用指标，但小檗碱是否通过影响上述指标发挥治疗膀胱癌作用的研究较少，小檗碱对于膀胱癌的作用及具体分子机制尚未明确.本研究选择膀胱癌患者癌组织以及T24膀胱癌细胞系为研究对象，初步探讨小檗碱在膀胱癌中的疗效及潜在作用机制，为临床使用小檗碱等民族药物有效成分进行抗膀胱癌治疗提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 患者组织样本与细胞系

膀胱癌组织样本(由南京中医药大学附属南京中医院泌尿外科提供，并经伦理委员会批准)；人膀胱癌细胞系T24细胞(由美国ATCC细胞库提供).

1.2 药物与试剂

小檗碱(批号:110713-202015，中国食品药品检定研究院)；吉西他滨(批号:100622-201903，中国食品药品检定研究院).

DMEM(批号:758136，美国Gibco公司)；胎牛血清(批号:KPF21391，美国Hyclone公司)；引物来自上海生工生物工程有限公司；VEGFA抗体(批号:ab1316)、PI3K抗体(批号:ab278545)、Akt抗体(批号:ab38449)、p-Akt抗体(批号:ab8805)全部来自美国Abcam公司.

1.3 T24细胞培养与分组

拟定常规培养，以1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素、10%胎牛血清制备DMEM培养基，环境条件为5% CO2、37℃.实验分组为:对照组、阳性药吉西他滨组(2μg/mL)、小檗碱低、中、高剂量组(0.05μg/mL、0.5μg/mL、5μg/mL)，小檗碱溶于0.1%DMSO.

1.4 CCK-8法对细胞增殖实施测定

准备T24细胞(对数生长期)，96孔板，按照1×105个/mL的密度进行接种，各孔分别注入100μL，按照3孔/组进行平行处理.各组依次给予对应药物100μL(其中对照组给予与其体积相同的培养液)，进行常规培养24 h后，量取100μL含10% CCK-8的无血清培养液进行补充，置于避光环境下进行孵育3 h，对各孔实施吸光度测定(450 nm处)(A)，然后计算细胞生存率，在此设定对照组为100%存活，按照公式求出细胞活性:

1.5 Transwell法测定细胞迁移

准备T24细胞(对数生长期)，以无血清DMEM培养基进行重悬处理.按照2×105个/mL的标准调整密度，采用含有小檗碱或吉西他滨的培养基进行稀释，对照组用相应体积的空白培养基，在小室的上层接种T24细胞(浓度为1×105个/mL)，设置体积为200μL/孔，约含细胞2×104个，按照3孔/组进行平行处理.准备加入1 mL完全培养液的24孔板，把小室转移到板上，底部要触及液面，避免有气泡形成，培养24 h后，取出小室，以适量PBS重复2次清洗，然后分别以4%多聚甲醛、1%吉姆萨实施固定和染色处理，以无菌棉签拭去上室细胞，倒置于显微镜下，随机截留5个图像，用于观察和计数穿膜细胞.

1.6 RT-PCR法检测VEGFA、VEGF-R2、PI3K、Akt的表达

实验分组参照前面“1.3项”，每组设3个复孔.Trizol法提出各组总RNA，并测定RNA含量，然后实施反转录获得cDNA，再实施RT-PCR实验，各引物的序列可参考表1.

表1 VEGFA、VEGF-R2、PI3K、Akt的引物序列Table 1 Primer sequences of VEGFA，VEGF-R2，PI3K and Akt

1.7 Western blot法测定蛋白表达

准备T24细胞(对数生长期)，饥饿细胞12 h，加药培养24 h后收集各组细胞.依次添加RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂(1%)，进行10 s涡旋处理，转移至冰上裂解30 min，然后于4℃环境下，进行5 min离心处理(12 000 r/min)，得到上清，通过Bradford法测定蛋白浓度.取10% SDS-PAGE凝胶电泳，加入事先准备好的30μg等量蛋白中，将蛋白转移于PVDF膜，然后用脱脂牛奶(5%)进行2 h封闭处理，再加入抗体GAPDH(1∶5 000)、Akt(1∶1 000)、PI3K(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、VEGFA(1∶10 000)、VEGF-R2(1∶1 000)，置于4℃环境下进行孵育，次日回收一抗，取出PVDF膜，用TBST清洗5 min，重复5次，取稀释后的二抗(1∶5 000)加入，于常温下孵育2 h，然后取适量TBST进行清洗，依次进行显影、曝光，图像扫描，计算蛋白灰度值.膀胱癌患者组织样本以100 mg:1 mL裂解液先实施裂解处理，然后把裂解后的组织离心处理，再测定上清中的蛋白浓度，处理样本，进行Western blot实验.

1.8 统计分析

上述各项指标检测均重复3次，数据全部以x-±s来表示，统计及作图统一借助Graph Pad Prism 7.0完成.多组对比实施单因素方差分析，以t检验实施组间对比，P＜0.05表明存在统计学差异.

2 结果

2.1 膀胱癌患者癌组织及癌旁组织中相关蛋白的表达

Western blot结果表明，与癌旁组织比较，癌组织中VEGF-R2、PI3K、Akt、p-Akt蛋白的水平显著上升.此外，VEGFA在癌组织中亦高表达，但无统计学差异.该结果表明，VEGF/PI3K/Akt信号通路在膀胱癌患者的膀胱组织中被激活，见图1.

图1 膀胱癌患者癌组织及癌旁组织中VEGFA、VEGF-R2、PI3K、Akt、p-Akt的蛋白水平Fig.1 Protein levels of VEGFA，VEGF-R2，PI3K，Akt and p-Akt in cancerous samples and adjacent normal samples of patients with bladder cancer

2.2 小檗碱对T24细胞增殖的影响

与对照组相比，给予不同浓度的小檗碱干预后，T24细胞失去了原有的增殖活性，说明小檗碱对T24细胞具有良好的细胞毒性，且具有剂量依赖性.吉西他滨组的T24细胞存活率亦大幅度下降.见表2.

表2 小檗碱对T24细胞增殖的影响(±S，n=10)Table 2 Effects of berberine on T24 cell proliferation(X ±S，n=10)

2.3 小檗碱对T24细胞迁移的影响

结果表明，上调小檗碱浓度，T24细胞逐渐失去了原本的迁移能力，尤其是小檗碱高剂量组(5μg/mL)的抑制作用最强.同时，吉西他滨亦能显著抑制T24细胞的迁移.见图2.

图2 小檗碱对膀胱癌T24细胞迁移的影响(100×)Fig.2 Effects of berberine on T24 bladder cancer cells migration(100×)

2.4 小檗碱对T24细胞相关基因表达的影响

与对照组比较，随着提高小檗碱给药浓度，T24细胞中的各个基因表达均明显降低(PI3K、Akt、VEGFA、VEGF-R2)，并表现出剂量依赖性.同时，阳性药吉西他滨组的T24细胞中上述基因水平亦显著下降.见图3.

图3 小檗碱对T24细胞中基因表达的影响Fig.3 Effects of berberine on the gene expressions in T24 cells

2.5 小檗碱对T24细胞中相关蛋白表达水平的影响

相较于对照组，阳性药吉西他滨组的T24细胞中VEGF-R2、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达出现大幅度下降.此外，VEGFA蛋白水平亦有下降，但无统计学意义.同时，在不同浓度小檗碱的干预下，T24细胞中上述蛋白的表达均显著下调，与“2.4”项下得到的结果不一致，蛋白水平只有VEGFA、VEGFA-R2表现出剂量依赖性，对其它3个蛋白未表现出剂量依赖性.见图4.

图4 小檗碱对T24细胞内蛋白表达水平的影响Fig.4 Effects of berberine on the expressions of proteins in T24 cells

3 讨论

膀胱癌是一种比较多发的泌尿生殖系统恶性肿瘤，这几年呈现出明显的高发与高致死趋势，极大地威胁着公众的健康.2019年中国约有8万人确诊为膀胱癌，其中死亡人数为3万人.膀胱癌患者术后易复发及化疗耐药性仍是其临床治疗的难点.而民族药物由于其药效靶点多[13]、治疗途径多[14]、安全可靠、无明显的副作用、成本低等优点[15]，故而寻找中药中的抗肿瘤活性成分对于治疗膀胱癌尤其重要.

小檗碱属于生物碱类化合物，提取于中药黄连，具有丰富的药理活性.周军挺[16]等研究表明，小檗碱能够经由p38信号通路，作用于结直肠腺癌细胞HCT-15，使其加快凋亡和自噬，从而能够抑制体内、外肿瘤的发展进程.曾智豪[17]等探讨了小檗碱对MCF-7乳腺癌小鼠体内肿瘤的影响，结果提示，小檗碱的抑瘤效果良好.王婉[18]等对SKOV3细胞增殖过程中小檗碱的作用进行了探讨.结果表明，小檗碱能够作用于卵巢癌细胞SKOV3，加速其凋亡过程，尤其是和顺铂联用时，具有协同增效的作用.上述研究结果提示，小檗碱具有良好的抗肿瘤活性.

本研究开始利用膀胱癌患者肿瘤组织，确认VEGF/PI3K/AKT信号通路在膀胱癌患者体内被激活.VEGF在肿瘤血管的形成中，扮演着关键的角色，对膀胱癌的发生、发展具有重要作用.肿瘤血管生成显著增加可造成肿瘤复发，缩短肿瘤患者的生存时间.因此，VEGF是膀胱癌治疗的潜在重要靶点.本研究结果表明，小檗碱可显著抑制膀胱癌细胞系中VEGFA及VEGF-R2的水平，提示小檗碱对T24细胞具有良好的细胞毒性.此外，Transwell实验表明，小檗碱对T24细胞的迁移作用亦有良好的抑制作用.PI3K/AKT信号通路在肿瘤细胞中通常会发生高表达.一般情况下，信号通路的异常激活大多是因为肿瘤细胞的恶性生物学行为所致，故而，对PI3K/AKT信号通路的调控和介入，或有可能成为抑制和阻断肿瘤发展的有效方法，开辟肿瘤治疗的新方向.结果提示，小檗碱对T24细胞中的PI3K及Akt具有显著的抑制作用.

综上所述，本研究表明小檗碱可显著抑制膀胱癌细胞系T24细胞的增殖、迁移，而且能够对其VEGF/PI3K/Akt信号通路产生干扰和抑制.本研究为小檗碱临床治疗膀胱癌提供数据支撑.