IL-17A、IL-17F和IL-23R基因多态性与结直肠癌易感性关系研究

李洪波,匡 黎

湖北医药学院附属东风医院肿瘤科，湖北十堰 431017

结直肠癌(CRC)是从结肠或直肠发展而来的癌症，年龄增加、不良生活方式和潜在遗传性疾病都是其影响因素[1]。一些遗传性疾病也是导致诱发结直肠癌的原因，包括家族性腺瘤性息肉病(FAP)和遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)[2-3]。现阶段，可以通过在结肠镜检查期间获取结直肠样本来诊断CRC，然后通过医学成像来确定疾病是否扩散[4]，但目前尚未完全预防和控制CRC。近期研究主要集中于白细胞介素(IL)介导的信号通路对结直肠癌细胞凋亡、迁移或侵袭的影响，或IL这类炎症相关指标对其他疾病(胃癌)易感性及其预后的影响，目前暂无详尽结直肠癌多样性的相关研究[5-7]。有报道显示，IL-17和IL-23R的某些等位基因可能与结直肠癌肿瘤进展风险降低相关，故本研究针对IL-17和IL-23R基因多样性与CRC易感性展开研究，现报道如下[8]。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年5月至2019年5月于本院进行治疗的140例CRC患者设为实验组。其中男78例，女62例，年龄31～68岁，平均(47.19±8.56)岁。实验组中结肠癌(CC)患者78例，直肠癌(RC)患者62例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期58例，Ⅲ期44例，Ⅳ期38例；肿瘤位于升结肠42例，横结肠34例，降结肠34例，直肠30例；腺癌120例，黏液腺癌14例，印戒细胞癌6例，其中中高分化50例，低分化90例；平均病程(5.64±2.11)年。纳入标准：符合CRC诊断标准[9]，年满18周岁，首次接受治疗，有病检样本，临床和诊断治疗齐全。排除标准：患胃部疾病(胃镜确诊)，有胃肠道手术史，有恶性肿瘤病史，对治疗药物过敏者，有近期相关治疗史者。另外选取2014年5月至2017年5月于本院进行体检的100例体检健康者作为对照组，其中男54例，女46例，年龄32～69岁，平均(47.56±8.49)岁。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本次研究对象选取及其后续实验均受本院伦理委员会批准，全部患者均自愿参与。

1.2检测方法

1.2.1DNA样收集 于清晨(9:00前)抽取所有被研究对象的外周静脉血2 mL，加入抗凝剂(EDTA-K2)后4 ℃下离心分离得到血细胞，使用试剂盒(GenElute，Sigma-Aldrich，美国)抽提血细胞DNA，然后利用琼脂糖凝胶检验目标DNA纯度和完整度，-80 ℃保存备用。

1.2.2基因多态性检验 利用聚合酶联反应-连接酶反应检测技术(PCR-LDR)检验IL-17A/F和IL-23R基因多态性，其中IL-17A rs2275913位点的扩增长度为494 bp，上游引物为5′-CGG AAT TGT CTC CAC AAC AC-3′；下游引物为5′-CAG GAG TCA TCG TTG TTT CT-3′，特异性引物扩增IL-17A基因的目的基因片段。IL-17Frs763780位点的扩增长度为401 bp，上游引物为5′-GCA AAC AAA CAC CTG AAG TA-3′；下游引物为5′-GTT CCC ATC CAG CAA GAG AC-3′，特异性引物扩增IL-17F基因的目的基因片段。IL-23Rrs10889677位点的扩增长度为453 bp，上游引物为5′-CAA TCT TGT TTC CAG AGT AGT GAC-3′,下游引物为5′-AAA AAT ACA TGA GGC GTC CA-3′。具体操作如下：引物和探针由上海百研生物科技公司完成合成，将DNA样本稀释至10 ng/μL后加1 μL至反应体系(包含引物混合物1 μL，Master mix 5 μL和3 μL ddH2O)。置入PCR仪，94 ℃下2 min变性后，进行11个94 ℃(20 s)-65 ℃(40 s)-72 ℃(60 s)的循环，在进入94 ℃(20 s)-59 ℃(30 s)-72 ℃(90 s)的24个循环，最后72 ℃ 120 s。随后加入1 μL Exol/SAP酶，37 ℃下恒温1 h后灭活。使用试剂盒进行双链接反应，将稀释后的连接产物送上海生工生物公司测序，使用DNAman9.0分析数据。IL-17A选择rs2275913位点，IL-17F选择rs763780位点，IL-23R选择rs10889677位点。

2 结 果

2.1高通量测序序列基本信息 使用illuminate平台目的基因高变区进行测序，数据获取剔除低质量reads后进行拼接，所获Tags平均拼接率约为95.00%，结果较为理想，见表1。

表1 高通量测序序列基本信息

2.2两组IL-17A基因及其等位基因频率比较 两组IL-17A(rs2275913)TT、TC和CC分布情况比较差异无统计学意义(P>0.05)。实验组IL-17F(rs763780)TT、TC和CC分布情况与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，但其等位基因分布差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 两组IL-17A/F基因及其等位基因频率比较[n(%)]

2.3两组IL-23R基因及其等位基因频率比较 实验组IL-23R(rs10889677)TT、TC和CC分布情况与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，但其等位基因分布差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 两组IL-23R基因及其等位基因频率比较[n(%)]

2.4IL-17F和IL-23R多态性与CRC患者临床表现间的关系 IL-17F(rs763780)单核苷酸基因频率与肿瘤分期相关，纯合子TT在中重度患者中分布明显少于轻度患者，差异有统计学意义(P<0.05)，且肿瘤位于升结肠的纯合子TT基因频率明显异于其他部位，差异有统计学意义(P<0.05)；IL-23R(rs10889677)位点单核苷酸基因频率与肿瘤分期及肿瘤部位差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。Logistic回归分析显示，IL-17F(rs763780)Ⅲ、Ⅳ期患者中TT基因型明显异于其他(CT+CC)基因型，差异有统计学意义(P<0.05)；肿瘤位于升结肠患者中IL-23R(rs10889677)CC基因型明显异于其他(TT+TC)基因型，差异有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表4 同临床表现患者IL-17F和IL-23R等位基因及其突变的比较(n)

表5 IL-17F和IL-23R多态性与CRC患者临床表现间的关系(95%CI)

3 讨 论

IL-17和IL-23都是促炎性细胞因子，IL-17由T辅助细胞17产生，以响应IL-23得到刺激[10]。近期相关研究发现IL-17和IL-23R的某些等位基因可能与结直肠癌肿瘤进展风险降低相关[11]。在IL-17家族成员中，IL-17F同种型1和2(ML-1)与IL-17A具有最高的序列同源性(分别为55%和40%)[1-3]。但是针对IL-17F的研究相对于IL-17A而言较少，且其在癌症发展中的作用尚不明确；另一方面，现阶段研究主要集中于IL-17F募集炎症因子、调节细胞因子或干预肿瘤血管生成方向[13]。此外，其他IL(如IL-1s、IL-8和IL-10等)虽然介导炎性反应，但未有明确结果证明他们基因的多态性影响肿瘤易感性。本研究发现实验组IL-17F的rs763780位点和IL-23R的rs10889677位点基因频率分布与对照组存在明显差异，这提示临床工作者IL-17F和IL-23R基因多态性可能和结肠癌存在一定的相关性。裴芳等[14]研究显示病毒性心肌炎IL-17A多态位点AA基因型和A等位基因频率均显著高于对照组，这与本研究的结果类似。同时，IL-23被证明可以促进许多其他免疫病理学模型中的炎症发展，包括关节炎模型，肠道炎症和牛皮癣；其中IL-23R作为IL-23信号传递因子也被证实与疾病易感性相关，与本研究结果一致[15]。

本研究结果显示，IL-17F(rs763780)单核苷酸基因频率与肿瘤分期相关，纯合子TT在中重度患者中分布明显少于轻度患者，且肿瘤位于升结肠的纯合子TT基因频率明显异于其他部位。因而本文推测，IL-17F的rs763780位点T向C的改变，可能增加CRC易感性；同理，IL-23R的rs10889677位点TC向CC的改变，也有可能是肿瘤位于升结肠的标志。研究表明，IL-23可以刺激Th17细胞的生长、分化和维持，而IL-23与存在于T淋巴细胞、NK细胞和DC细胞上的IL-23R结合，介导这些细胞内信号传递，故其控制肿瘤的发生和发展[15-16]。而Th17细胞得到生长、增殖和分化又会产生大量IL-17，从而形成IL-23/IL-23R/Th-17/IL-17通路。这些反应引起细胞内DNA的复制和转录异常，从而引发肿瘤的发生和发展[17-18]。另一方面，本研究指出IL-17F rs763780位点和IL-23R rs10889677基因多态性与CRC病症相关，但本文仅针对该基因上的一个位点进行研究，下一步，本文也需要多位点分析，收集更多临床治疗，分析患者年龄和血清各指标参数等与IL-17A/F和IL-23R不同基因型与临床特征的差异。同时，本文分析了CC和RC患者IL-17A/F和IL-23R间时候存在基因频率差异，为临床诊断和治疗提供依据。

综上所述，IL-17F(rs763780)和IL-23R(rs10889677)可能影响结直肠癌患者的易感性，其多核苷酸多态性分别与患者肿瘤分期、肿瘤部位相关。