固定化脂肪酶Lipozyme TL IM催化葫芦籽油合成脂肪酸乙酯工艺研究

木太里普·吐逊，刘 艺，李志辉，尹 辉，麦合苏木·艾克木

（1乌鲁木齐市中医医院药学部，乌鲁木齐 830000;2新疆医科大学维吾尔医学院，乌鲁木齐 830011）

葫芦籽为葫芦科葫芦[Lagenaraia siceraria（Moli⁃na）Standl.]的成熟种子，兼具药用与食用价值[1]。葫芦籽具有利尿降糖、润燥解渴、去热清肝等功效，临床上多用于糖尿病、发烧发热、肝炎等的治疗[2]。研究结果显示，葫芦籽含油量达到45.3 %，其中不饱和脂肪酸高达70.49 %，尿素包合后其亚油酸含量达到91.67 %[3-4]。不饱和脂肪酸乙酯尤其是亚油酸乙酯（LA）拥有诸多生理活性，如增强免疫力、预防或减轻动脉粥样硬化、抗癌、下调机体血脂与胆固醇水平等[5-13]。目前固定化LPS 催化法是制备脂肪酸乙酯的常用方法，具有工艺简单，醇需量低，反应条件温和，可重复应用固定酶等特点[14-15]。本研究以葫芦籽油和乙醇为原料，以固定化脂肪酶Lipozyme TL IM 为催化酶，通过单因素试验和响应面分析法（RSM）优化葫芦籽油脂肪酸乙酯合成工艺，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 药材葫芦籽药材购买于安徽济善堂中药科技有限公司，经乌鲁木齐市中医医院药房主任刘艺中药师鉴定为葫芦科葫芦[Lagenaraia siceraria（Molina）Standl.]的成熟种子。

1.2 试药Lipozyme TL IM（丹麦诺微信酶制剂公司，批号9001-62-1），石油醚（天津市鑫铂特化工有限公司，批号20191218），无水硫酸钠（天津市河东区红岩试剂厂，批号20180604）），无水乙醇（天津市汇杭化工科技有限公司，批号20201127），KOH（天津益力化学试剂有限公司，批号20190709），NaOH（天津市风船化学试剂科技有限公司，批号20180302），以上试剂均为分析纯。

1.3 仪器HH-4型电热恒温水浴锅（常州万合仪器制造有限公司），7890A-5975c 型GC-MS 联用仪（美国Agilent公司），KQ-250DA型超声清洗器（南京晓晓仪器设备公司），DF-101T 型集热式恒温加热磁力搅拌器（上海坦泽仪器设备有限公司），GZX-GFC 型电热恒温鼓风干燥箱（上海庚庚仪器设备有限公司），AUY220 型电子分析天平（日本岛津公司），N-1100D型蒸发仪（上海弘懿仪器设备有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 葫芦籽油脂制备 称取10 g 葫芦籽粉末，在105 ℃温度下烘30 min，把内置试样的滤纸筒放到提取仪抽提筒中，注入石油醚（沸程30℃～60℃），提取8 h，减压回收石油醚，即得葫芦籽油脂。

1.4.2 葫芦籽油脂肪酸乙酯的合成 将葫芦籽油与EtOH混合物置于具塞三角瓶内，加入正己烷，放入水浴恒温振荡器充分混合，加入Lipozyme TL IM 启动反应。反应式：CH2OOCR1-CHOOCR2-CH2OOCR3+3CH3CH2OH→3CH3CH2COOR+CH2OH-CHOH-CH2OH。待反应终止，过滤，蒸馏回收EtOH，移入分液漏斗内，洗涤即得葫芦籽油脂肪酸乙酯。

1.4.3 脂肪酸乙酯转化率的测定 借助皂化-高碘酸氧化法，测定脂肪酸乙酯转化率。具体步骤为，10 g葫芦籽油脂肪酸乙酯，加入10 mL40% KOH-C2H5OH溶液，回流30 min，,加入10mL 40% H2SO4酸解，待溶液分层后将下层甘油相转入200mL 容量瓶中，并用适量水洗涤脂肪酸层。水层溶液中准确移取25.0 mL置于250 mL 碘量瓶中，加20 mL 0.02mol/L KIO4溶液,10 mL 3mol/L H2SO4溶液，盖好塞盖，,摇匀，室温下于暗处放置30 min。然后加入2g KI，再加水150 mL，析出的碘用配制好的Na2S2O3标液滴定。以下为相应公式：甘油= [(V0-V)×C×M]/(W×25/200×4×1 000) 计算脂肪酸乙酯转化率%，式中V0为空白消耗Na2S2O3标液体积（mL）；V 为试样消耗Na2S2O3标液体积（mL）；C为Na2S2O3标液浓度（mol/L）；M 为甘油的摩尔质量（g/mol）；W 为分析试样质量（g）。酯化率=（甘油于原料油内的理论含量-甘油于产物内含量/甘油于原料油内的理论含量× 100 %

1.4.4 单因素试验 以脂肪酸乙酯转化率为指标，固定其他条件，开展单因素试验。在单因素梯度方面，Lipozyme TL IM 质量分数设定为10 %～50%（期间以10%递增），醇油摩尔比的设定为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1和5∶1；反应时间的设定为12 h～28 h（期间以4 h递增）；反应温度的设定为20 ℃～60 ℃（期间以10 ℃递增）。若改变各单因素，基于单因素试验结果参数固定条件，各组试验设置3次重复测定，将均值作为终值。

1.4.5 响应面优化试验 基于单因素试验，将醇油摩尔比、Lipozyme TL IM 添加量、反应时间与温度当做响应值，遵循Box-Behnken 中心组合设计原理，确定出3个影响因子，即浸提温度、浸提时间与料液比，试验设计见表1。

表1 响应面分析试验水平表

1.4.6 葫芦油脂肪酸乙酯GC-MS 分析 GC 条件：HP-5MS 石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 µm）；程序升温：控制柱箱初始温度为150 ℃，由10 ℃/min 上调至300 ℃，并计时10 min，He（载气）流速1.0 mL/min，分流比50∶1，进样量0.3 µL。MS条件：EI源电子束能量为70 eV，传输线和离子源温度分别为280 ℃、230 ℃，质量扫描范围40～800 m/z，溶剂设定2 min 的延迟时间。比对Nist14标准质谱库，通过峰面积归一化法，分析各化合物的相对含量。

2 结果

2.1 单因素考察

2.1.1 醇油摩尔比的考察 当醇油摩尔比为4∶1，FAEE转化率最高，故确定醇油摩尔比为4∶1，见图1。

图1 醇油摩尔比对脂肪酸乙酯转化率的影响

2.1.2 Lipozyme TL IM 质量分数的考察 当Lipozyme TL IM 质量分数为30 %，FAEE 转化率最高，故确定LPS质量分数为30 %，见图2。

图2 脂肪酶质量分数对脂肪酸乙酯转化率的影响

2.1.3 反应温度的考察 当反应温度为50 ℃时，FAEE转化率最高，故确定反应温度为50 ℃，见图3。

图3 反应温度对脂肪酸乙酯转化率的影响

2.1.4 反应时间的考察 当反应时间为24 h，FAEE转化率最高，故确定反应时间为24 h，见图4。

图4 反应时间对脂肪酸乙酯转化率的影响

2.2 响应曲面数据分析

2.2.1 响应面试验设计和结果 基于单因素试验，借助响应曲面法对反应调价加以优化。 采取Box-Behnken 试验设计，自变量如下：A：醇油摩尔比；B：Lipozyme TL IM 质量分数；C：反应温度；D：反应时间；FAEE 是响应值R，借助软件Expert 8.0.6 对试验方案加以明确，并通过此软件对此方案所得试验结果展开分析，见表2。

表2 响应面试验设计与结果

2.2.2 响应面试验数据分析将FAEE 转化率当做响应值，针对试验数据，借助软件Design Expert 8.0.6 实施二次多元回归拟合，完成二次响应面回归模型的构建。由响应值、各影响因子形成的回归方程如下：R=85.43＋0.32 A＋4.15 B-0.67 C＋1.98 D＋1.62 AB-0.48 AC-0.34 AD＋0.32 BC＋0.93 BD＋1.27 CD-6.52 A2-5.83 B2-1.45 C2-2.07 D2，所得模拟方程的相关性较好，决定系数R2=0.916 3，对回归模型开展方差分析结果见表3。制备模型的P值在0.01 以下，体现出极显著性，失拟项的P=0.1018 >0.05，无显著性，由此可见，所建模型可用于脂肪酸乙酯转化率的响应面分析。B、A2、B2 的P< 0.01，和FAEE 转化率存在显著联系。分析AB、AC、AD、BC、BD、CD 项发现，P值均在0.05 以上，表明上述4 项因素对FAEE 转化率的影响缺乏显著交互效应。等高线图越接近椭圆表示交互作用越显著，响应面曲图的坡度越陡，则该因素对水解率的影响越大。各因素交互效应影响的登高线图和响应面图表面，B对脂肪酸乙酯转化率的影响大于A，见图5；A对脂肪酸乙酯转化率的影响大于C，见图6；A 对脂肪酸乙酯转化率的影响大于D，见图7；B 对脂肪酸乙酯转化率的影响大于C，见图8；B 对脂肪酸乙酯转化率的影响大于D，见图9；C、D 对脂肪酸乙酯转化率的影响均不明显，见图10。通过综合分析能够明确，FAEE 转化率影响程度由大至小依次是B（LPS 质量分数）、A（醇油摩尔比）、C（反应时间）、D（反应温度）。

图5 A（醇油摩尔比）、B（LPS质量分数）交互效应影响的响应面图与等高线图

图6 A（醇油摩尔比）、C（反应温度）交互效应影响的响应面图与等高线图

图7 A（醇油摩尔比）、D（反应时间）交互效应影响的响应面图与等高线图

图8 B（脂肪酶质量分数）、C（反应温度）交互效应影响的响应面图与等高线图

图9 B（脂肪酶质量分数）、D（反应时间）交互效应影响的响应面图与等高线图

图10 反应温度C、反应时间D交互作用影响的等高线图及响应面图

表3 响应面二次模型的方差分析

2.3 验证试验通过响应面分析试验对脂肪酸乙酯转化率的影响进行了优化分析，得到的最优条件为：醇油 摩 尔 比为4.06∶1、Lipozyme TL IM 质量 分 数 达34.9 %，另反应时间、温度各为26.34 h 、49.78 ℃时，最佳FAEE 转化率预测达86.79 %。鉴于可操作性，可将醇油摩尔比、Lipozyme TL IM 质量分数、反应时间与温度依次调整成4∶1、35 %、26 h 与50 ℃，经由3次试验，对最佳合成工艺展开检验，可实现(85.74%± 0.43%)的FAEE 转化率，相比预测值差值为1.05 %，整体和预测值较为接近，可见此响应面分析模型所得最优工艺条件在可靠性上有着良好表现。

2.4 葫芦油脂肪酸乙酯GC-MS 分析通过气相色谱- 质谱联用仪对固定化脂肪酶催化葫芦籽油合成FAEE 开展分析，同时借助峰面积归一化法，对酶类Lipozyme TL IM 相对含量展开计算。结果由表4 所示，不饱和脂肪酸乙酯含量达73.55 %，其中亚油酸乙酯的含量为58.483 %，油酸乙酯含量为15.07 %，见表4。

表4 固定化脂肪酶催化葫芦籽油合成脂肪酸乙酯GC-MS分析

3 讨论

脂肪酸乙酯化作为生物柴油，在工业上应用广泛。不饱和脂肪酸乙酯，特别是LA在增强免疫活性、预防或减轻AS、抗癌、下调机体血脂以及胆固醇水平等具有较大的研发和应用潜能。本研究以葫芦籽油为原料，合成工艺简便可控，适用于葫芦籽油脂肪酸乙酯的合成，为葫芦籽的开发利用提供了实验基础。