老年2型糖尿病牙周炎患者牙周治疗后龈下菌群变化及对糖代谢的影响

牛家慧 李创 李蓉 胡永权 张江畔 苑学微 樊静珊 张亚宏

(石家庄市第二医院口腔科，河北 石家庄 050051)

糖尿病(DM)和慢性牙周炎(CP)是世界范围内的两种常见慢性疾病，近年来的学术观点认为，两者之间相互影响、相互促进，DM是促进CP发生和发展、诱发牙槽骨代谢异常和丢失的重要危险因素之一〔1〕，DM人群患CP的风险和疾病程度要高于普通人群，而CP的治疗情况也会对DM患者的血糖控制水平产生影响〔2〕。因此，提高针对DM合并CP的筛查诊断率和预防控制效果已成为口腔医生面临的新挑战。一般来说，临床上提倡针对DM合并CP患者进行有效的全身和口腔管理，牙周基础治疗对于CP具有良好的预防和治疗作用，研究证实针对2型糖尿病(T2DM)合并CP患者给予牙周基础治疗，对于缓解CP发展进程和改善患者糖代谢状态均可能具有积极的作用〔3，4〕，但缺乏针对牙周基础治疗前后龈下菌群变化的评价研究，特别是未见针对伴有骨质代谢异常、器官功能障碍等基础疾病的老年患者人群的专题性前瞻性研究，故本文采用高通量测序技术对老年T2DM合并CP患者牙周治疗后龈下菌群的变化及对糖代谢的影响进行分析。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年6月至2020年8月石家庄市第二医院口腔科住院治疗的106例老年T2DM合并CP患者作为研究对象，应用随机数字表法将其分为研究组和对照组，每组各53例。两组一般资料差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 两组一般资料比较

所有患者对本研究知情并签署知情同意书，本研究方案经医院医学伦理委员会审核通过。

1.2纳入与排除标准 纳入标准：(1)T2DM诊断标准参照中华医学会糖尿病学分会制订的《中国2型糖尿病防治指南》中的T2DM诊断标准〔5〕，具体诊断标准如下：①具有多尿、多饮及体重下降等DM症状，任意时间随机血糖≥11.1 mmol/L和(或)空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L；②无DM症状但符合上述2项血糖异常诊断标准，同时口服75 g葡萄糖后2 h血糖≥11.1 mmol/L。(2)CP诊断标准参照中华医学会编制的《临床诊疗指南·口腔医学分册》中的CP诊断标准〔6〕，患者牙龈变色、质松软、龈缘变厚、龈乳头变圆钝、牙龈组织表面光亮或点彩消失等临床表现，可伴有牙龈肥厚、牙齿松动和移位、牙髓病变、牙周脓肿、牙龈退缩、牙根面敏感等，可见牙龈红肿或探诊后有出血，探诊深度>3 mm且附着丧失>1 mm，X线片检查可见牙槽骨吸收。所有患者为轻度或中度牙周炎，其中轻度牙周炎诊断标准为：牙属周袋深度<4 mm，X线片检查显示牙槽骨吸收≤根长的1/3。中度牙周炎诊断标准为：牙周袋深度≥4 mm且<6 mm，X线片检查显示牙槽骨吸收>根长的1/3且<根长的1/2。均经专业口腔医师检查确认非必须行牙周治疗。临床资料完整。排除标准:(1)合并恶性肿瘤、肝肾功能不全、全身感染性疾病、免疫缺陷症、血液系统疾病、终末期或急性DM并发症的患者；(2)有牙周治疗史及入组前2个月内应用抗菌药物、免疫调节剂、糖皮质激素史的患者；(3)有牙周治疗应用禁忌者。

1.3治疗方法 两组患者入组后均给予牙周健康教育、饮食调节、戒烟戒酒等治疗，指导患者采用正确的刷牙方法，多摄入蛋、蔬菜、低脂食品等有益于牙齿健康的食物，同时强化控制血糖，严格限制含糖食品的摄入，选用适合的口服降糖药物和(或)胰岛素治疗，达到血糖控制目标准，即FPG 4.4～7.0 mmol/L，餐后2 h血糖(2 hPG)5.6～10.0 mmol/L。研究组在上述治疗的基础上给予牙周基础治疗，具体方法为采用超声洁治器给予龈上洁治术，在清除菌斑、牙石后行根面平整术和龈下刮治术，术后每日3次以氯己定漱口。

1.4观察指标

1.4.1龈下菌群情况 于入组治疗前及治疗3个月时采集两组龈下菌斑，采集方法为：在受检对象口内选择磨牙探诊深度≥4 mm且存在附着丧失的位点进行采样。去除龈上菌斑，棉卷隔湿所选患牙，吹干牙面，使用消毒的Gracey刮治器伸至牙周袋袋底，沿牙体长轴尽可能刮取全部龈下菌斑，所获样本立即转入1.0 ml灭菌的3%硫乙醇酸盐溶液，-20℃冷冻保存待用。立刻送微生物实验室。采用16S rRNA 基因高通量测序检测法对龈下菌斑中菌群构成进行检测，测序设备为Novaseq型第二代高通量测序仪(美国 Illumina 公司)，采用OSR-M502型TGuide 细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取所得菌斑内的基因组DNA，采用细菌16 s V2-V4区特异性引物作为引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，上游引物序列为5′-CGTGGACCAAAGATTCATCGGTGGA-3′，下游引物序列为5′-CCGCTT TACTCCCCA ACA AA-3′。反应体系为20 μl，反应条件为：95℃ 3min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，72℃10 min。所得产物采用琼脂糖凝胶电泳得到对应不同菌种的DNA条带，采用Fluorchem2.0电泳凝胶成像分析软件对电泳条带的平均灰度值进行分析，计算细菌的相对含量。

1.4.2糖代谢和血脂指标 于入组治疗前及治疗3个月时采集两组空腹外周静脉血样本，采用Cobas e411型全自动血液生化分析仪(瑞士罗氏公司)对FPG、糖化血红蛋白(HbA1c)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)进行检测。

1.5统计学方法 采用SPSS23.0 软件进行t检验、χ2检验或Fisher确切概率法。

2 结 果

2.1两组治疗前、后龈下菌斑菌群相对含量 治疗前，两组龈下菌斑中各类病原菌相对含量差异无统计学意义(P>0.05)，治疗3个月时，两组龈下菌斑中各类病原菌相对含量均较治疗前明显下降(P<0.05)，且研究组均明显低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组治疗前、后龈下菌斑菌群相对含量比较

2.2两组治疗前、后糖代谢和血脂指标 治疗前，两组糖代谢和血脂指标水平差异无统计学意义(P>0.05)，治疗3个月时，两组FPG、HbA1c、TG水平均较治疗前明显下降，且研究组均明显低于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 两组患者治疗前、后糖代谢和血脂指标的对比

3 讨 论

老年T2DM合并CP患者普遍具有向心性肥胖、血糖控制不佳和脂质代谢异常的特征〔7〕。DM和CP看似截然不同的两种疾病，但两者却具有相同的遗传背景、系统免疫应答过激状态及吸烟、高龄、冠心病、精神压力、白细胞功能障碍等临床危险因素〔8〕。研究认为，高血糖导致的高炎症状态、破骨活动增强和骨修复减弱的骨代谢平衡失调、糖基化终末产物堆积及与其受体相互作用等均参与了CP的发生和发展〔9，10〕，特别是中性粒细胞等炎症细胞的趋化吞噬功能受损、信号转导受阻、抗菌物质和细胞因子过表达、凋亡延迟和细胞毒性物质释放等免疫炎症机制在其中扮演着重要的角色〔11，12〕。相关研究显示，DM合并CP患者的手指末梢血的血糖、HbA1c水平与龈沟血均具有高度的一致性，在CP患者人群中，DM的患病率超过了60%，口腔专科甚至成为筛查DM的重要场所，在糖尿病前期患者中，CP的病变程度与其糖耐量水平也具有相关性〔13，14〕。因此，口腔临床医生应高度重视DM与CP的相关依赖关系，对于具有典型CP病变的老年患者，应同时注意评价其糖代谢情况和DM患病风险。

本研究结果显示，福赛斯坦纳菌、牙龈卟啉单胞菌等厌氧菌是DM合并CP患者龈下菌斑中相对含量较高的病原菌，这与研究〔15〕结果基本一致。相关研究结果显示，相对于健康人群和单纯CP患者，T2DM合并CP患者唾液及龈下菌斑中的牙龈卟啉单胞菌、放线共生放线杆菌、放线共生放线杆菌的检出率要明显偏高，可疑致病菌的种类和数量均存在差异〔16，17〕，这可能与DM具有密切的相关性，中重度牙CP患者的牙龈卟啉单胞菌和中间型普雷沃菌检出率均高于轻度患者，而HbA1c较高的中重度CP患者的福赛斯坦纳菌检出率及相对含量也较高。同时，T2DM合并CP患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的菌毛蛋白A基因型也与单纯CP患者具有明显的差异，此类患者更易感染毒力较强的菌毛蛋白AⅡ型牙龈卟啉单胞菌〔18〕，这都说明了DM患者糖代谢异常的加剧，其全身微环境的改变可对牙周局部菌斑微生物的定植种类及毒力产生影响。本研究采用了高通量测序技术作为检测技术，高通量测序技术被称为二代测序技术，采用了基于焦磷酸测序的并行测序技术，能够以更低的检测成本获得更高通量的数据并实现大规模的基因组研究，在单次运行中可同时对多达数百万个DNA分子进行测序，是DNA测序技术发展中里程碑式的突破，已被应用于众多的肿瘤诊断、靶向治疗等多个临床领域〔19〕，在微生物检测领域，高通量测序技术也在病原菌鉴定、耐药机制研究、药物新靶点分析、耐药菌流行病学、抗感染用药指导等方面体现出了独特的优势，应用越来越广泛，成为病原微生物研究领域中一项新的研究技术和方法〔20〕。本研究采用高通量测序技术实现了对患者龈下菌斑中病原菌相对含量的快速、准确检测，取得了较好的应用效果。

研究显示，牙周基础治疗能够显著改善牙周支持组织状态、降低龈沟局部的炎症因子表达、减少高毒力病原菌定植、下调内皮细胞免疫炎症基因〔21〕，但针对轻中度CP的周牙基础治疗是否必要方案仍然是一项具有争议的课题。研究者发现牙周基础治疗可有效提升口腔的清洁度并改善牙周状况，另一方面，牙周基础治疗还能够减轻T2DM患者的胰岛素拮抗程度，提升胰岛素敏感脂肪因子的表达水平，有利于改善患者的糖脂代谢异常〔22，23〕。本研究提示牙周基础治疗对于改善患者口腔微生物环境和糖代谢状态具有积极的意义。分析其原因，牙周基础治疗可能通过对牙周病原菌的清除下调患者口腔局部及全身的炎症反应程度，从而缓解对牙周组织和代谢器官的炎症损害，进而发挥治疗作用〔24，25〕。

综上，针对合并轻中度CP的老年T2DM患者给予牙周基础治疗，能够有效减少其龈下菌斑中的厌氧致病菌含量，改善患者的糖代谢及脂质代谢指标，具有较好的辅助治疗效果。