环状RNA hsa_circ_002059在胃癌患者组织与循环血液中的表达及意义

李荣，江佳佳,2，钱晖，许文荣,2

(1.江苏大学医学院，江苏省检验医学重点实验室，江苏镇江 212000；2.江苏大学澳洋肿瘤研究院，江苏张家港 215600)

胃癌是我国最常见恶性肿瘤之一，现阶段急需发掘新的生物学标志物并建立方便、微创、灵敏和特异的诊断方法[1]。近年来研究发现，环状RNA(circular RNAs，circRNAs)广泛存在于人体各组织和体液(包括外泌体)中，种类与数量丰富，具有稳定性、物种保守性和组织、时序、疾病特异性，目前已成为最具前景的分子标志物[2]。此外，环状RNA在多种疾病尤其是肿瘤中具有重要的调控作用，可作为miRNA分子海绵，通过碱基配对吸附miRNA，解除其对下游靶基因的抑制效应，具有作为新型治疗靶点的潜在价值[3]。另有研究表明，环状RNA与胃癌进展密切相关，可作为胃癌诊疗的新分子标志物[4]。因此，本研究建立检测环状RNA hsa_circ_002059表达的实时荧光定量RT-PCR法，并探讨其在胃癌组织与外周循环血液中表达的临床意义。

1 材料和方法

1.1主要试剂及仪器 miRNeasy 组织细胞RNA提取试剂盒、miRNeasy血浆RNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)，HiScript逆转录试剂盒、AceQ定量PCR试剂盒、10×DNA上样缓冲液、100 bp DNA Marker(南京诺唯赞公司)，ExoQuick血浆外泌体提取试剂(美国SBI公司)。NanoDrop ND-2000微量分光光度计(美国Thermo公司)，CFX96实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)，GenoSens凝胶成像分析仪(上海勤翔仪器公司)。

1.2标本来源 收集于2015年4月至2016年11月在镇江市第一人民医院普外科初次确诊为原发性胃癌患者的组织标本87例，其中男性63例，女性24例，年龄35～88岁，中位年龄66岁。纳入标准：(1)经临床医师确诊为原发性胃癌，组织病理切片经病理科医师复核确认；(2)患者术前无放、化疗等抗癌治疗史。排除标准：(1)排除转移和术后复发肿瘤以及胃良性肿瘤；(2)合并其他良恶性肿瘤；(3)伴有糖尿病、精神疾病、免疫疾病、肝肾功能不全、心衰等。收集于2017年1月至2018年6月在镇江市第一人民医院普外科初次确诊为原发性胃癌术前患者的外周血样本62例(其中10例血浆样本因试验过程中损失，丢失相应数据)，其中男性51例，女性11例，年龄38～85岁，中位年龄68岁。并收集同期年龄、性别匹配的体检健康者62例，其中男性51例，女性11例，年龄38～85岁，中位年龄68岁。本研究通过江苏大学医学伦理委员会审核批准(批准文号：江大校[2020]161)，各研究对象均签署知情同意书。

1.3组织及外周血标本采集 取上述经外科手术切除获取的胃癌患者新鲜胃癌组织和距离肿瘤边缘5 cm以上的邻近癌旁组织，置于-80 ℃保存。以EDTA-K2真空抗凝管采集胃癌患者术前以及体检健康者体检时的空腹静脉血2 mL，2 h内以4 ℃、3 000×g离心10 min分离血浆，以每管250 μL分装至1.5 mL进口Ep管，置于-80 ℃保存。

1.4总RNA提取及cDNA合成 组织样本采用液氮研磨法破碎，按照miRNeasy组织细胞RNA提取试剂盒说明书提取组织RNA。血浆样本置于冰上融化，以4 ℃、3 000×g离心15 min，取上清液，按照miRNeasy血浆RNA提取试剂盒说明书提取血浆RNA。按每250 μL血浆加入63 μL ExoQuick血浆外泌体提取试剂、沉淀获得血浆外泌体，再按照miRNeasy血浆RNA提取试剂盒说明书提取血浆外泌体RNA。采用NanoDrop ND-2000微量分光光度计测定RNA浓度与纯度，选取吸光度(A260 nm/A280 nm)比值为1.8～2.0的样本用于后续试验，RNA样本置于-80 ℃保存，避免反复冻融。按照HiScript逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，并置于-20 ℃保存。

1.5hsa_circ_002059与胃癌相关分析 登录circ2Traits数据库(http://gyanxet-bata.com/circdb/)首页，选择疾病类型为“胃癌”，预测hsa_circ_002059与胃癌有关的可能性。登录starBase v2.0数据库(http://starbase.sysu.edu.cn/)首页，输入环状RNA分子名称“hsa_circ_002059”，分析hsa_circ_002059与胃癌相关miRNA的结合位点。

1.6引物设计及实时荧光定量RT-PCR扩增 参照参考文献[5]，采用Primer Premier 5.0引物设计软件，并使用NCBI Primer Blast数据库分析设计引物，引物由美国Invitrogen公司合成。hsa_circ_002059(circBase ID：hsa_circ_0000140)上游引物序列：5′-CCCGATAACACAAGTGCAGC-3′，下游引物序列：5′-CCTGGACCTTCCACCTTCTC-3′，退火温度为60 ℃，扩增产物长度为126 bp。内参基因β-actin(GeneBank ID：NM_001101.5)上游引物序列：5′-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游引物序列：5′-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3′，退火温度为60 ℃，扩增产物长度为265 bp。采用AceQ定量PCR试剂盒及CFX96实时荧光定量PCR仪进行实时荧光定量RT-PCR反应。PCR反应总体系为20 μL，含cDNA模板2 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，2×qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，灭菌蒸馏水7.2 μL。PCR循环参数：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40个循环；于60 ℃时采集荧光信号，使用仪器配套的CFX Manager软件进行熔解曲线分析，并检测PCR产物特异性。每个样本设置3个复孔，设置固定阈值记录Ct值，取3次PCR结果计算平均Ct值，采用相对定量法(-△Ct法)计算各样本hsa_circ_002059的表达水平，公式：△Ct=Cthsa_circ _002059-Ctβ-actin。PCR产物以15 g/L琼脂糖凝胶电泳，于EB染料中染色15 min后置于凝胶成像仪中显像并拍照。

1.7统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。计量资料不符合正态分布，以中位数(四分位数)[M(P25，P75)]表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验，率的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。以ROC曲线分析评估hsa_circ_002059对胃癌的筛查价值，Kaplan-Meier 联合log-rank检验分析生存时间。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1hsa_circ_002059与胃癌进展的关系 数据库circ2Traits分析结果显示，hsa_circ_002059与胃癌有关(P=0.000 000 48)。数据库starBase v2.0分析结果显示，hsa_circ_002059与9种miRNA(hsa-miR-3118、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-149-5p、hsa-miR-296-3p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-96-5p)具有结合位点，其中8种miRNA均被报道参与了调控胃癌进展过程[6-13]。

2.2hsa_circ_002059检测的实时荧光定量RT-PCR法评价 采用荧光定量RT-PCR检测胃癌组织、血浆和血浆外泌体中hsa_circ_002059的结果显示，熔解曲线为单峰无杂峰，且扩增产物Tm值均一。阴性对照体系在扩增40个循环后仍未检测出荧光信号。琼脂凝胶电泳显示扩增产物为单一条带，且分子量符合理论大小。

2.3hsa_circ_002059在胃癌组织中的表达及临床价值 实时荧光定量RT-PCR检测结果表明，胃癌组织中hsa_circ_002059的表达水平[-8.60(-10.60，-6.81)]显著低于癌旁组织[-4.47(-7.15，-3.18)]，差异有统计学意义(U=1 759.0，P<0.001)。以胃癌组织组为疾病组，以癌旁组织为对照组，绘制ROC曲线评估组织hsa_circ_002059对胃癌筛查效能，结果表明其ROC曲线下面积(AUCROC)为0.768(95%CI：0.690～0.845)，当cut-off值为-5.503时，其筛查胃癌的敏感性为0.67，特异性为0.92，见图1A。

以cut-off值为界，将患者分为hsa_circ_002059高表达组(17例)和低表达组(70例)。胃癌组织中hsa_circ_002059低表达与较大的肿瘤体积有关(χ2=6.183，P=0.013)，见表1。生存曲线分析显示，低表达hsa_circ_002059的胃癌患者具有较短的预后生存时间的趋势(平均生存时间：27.8个月vs 33.3个月)，但差异无统计学意义(χ2=1.618，P=0.203)，见图1B。

注：A，组织hsa_circ_002059筛查胃癌的ROC曲线；B，组织hsa_circ_002059高表达组和低表达组胃癌患者生存率的比较。

表1 胃癌组织中hsa_circ_002059的表达与患者病理参数的关系

2.4hsa_circ_002059在胃癌患者血浆及血浆外泌体中的表达与分析 荧光定量RT-PCR结果显示，胃癌患者血浆中hsa_circ_002059表达量[-8.87(-10.51，-7.50)]较体检健康者[-10.22(-10.72，-8.58)]显著升高(U=1 011.5，P=0.027)。以胃癌患者为实验组，体检健康者为对照组，以ROC曲线评估血浆hsa_circ_002059对胃癌筛查的效能，结果显示AUCROC为0.626(95%CI：0.518～0.734)，当cut-off值为-9.416时，其筛查胃癌的敏感性为0.65，特异性为0.64，见图2A。

以cut-off值为界，将胃癌患者分为hsa_circ_002059高表达组(33例)和低表达组(19例)，结果发现胃癌患者血浆中hsa_circ_002059高表达与胃癌淋巴结转移有关(χ2=12.231，P=0.005)，见表2。生存曲线分析显示，血浆中高表达hsa_circ_002059的胃癌患者较低表达患者的预后生存时间显著缩短(平均生存时间：34.5个月vs 45.8个月)，差异具有统计学意义(χ2=4.594，P=0.032)，见图2B。荧光定量RT-PCR结果显示，胃癌患者血浆外泌体hsa_circ_002059的表达水平[-9.84(-11.61，-4.95)]与体检健康者[-9.84(-10.51，-7.83)]相比，差异无统计学意义(U=1 746.0，P=0.379)。

注：A，血浆hsa_circ_002059筛查胃癌的ROC曲线；B，血浆hsa_circ_002059高表达组和低表达组胃癌患者生存率的比较。

表2 胃癌血浆中hsa_circ_002059的表达与患者组织病理参数的关系

3 讨论

近年来，许多环状RNA被发现异常表达于肿瘤中且具有诊断与预后评估价值。如在肝癌组织中呈显著高表达的hsa_circ_0128298可用于肝癌的辅助筛查(AUCROC为0.661)与不良预后的判断[14]。本研究利用生物信息学预测确定hsa_circ_002059为胃癌相关环状RNA，对其设计了特异性引物并建立了荧光定量RT-PCR方法，经验证该方法可以用于检测组织、血浆和外泌体中hsa_circ_002059的表达水平。

笔者进一步检测发现，hsa_circ_002059低表达于胃癌组织(AUCROC达0.768)，显著优于传统的胃癌诊断标志物CEA、CA19-9、CA72-4(AUCROC分别为0.653、0.639、0.685)[15]，具有胃癌辅助筛查价值。此外，血浆中高表达hsa_circ_002059的胃癌患者相较于低表达患者的平均生存时间明显缩短，故而hsa_circ_002059可用于胃癌患者不良预后评估。尽管Sun等[16]发现血浆中显著低表达的has_circ_0000520可作为胃癌诊断标志物，其诊断效能显著高于组织样本检测(AUCROC：0.897 vs 0.613)，且循环血液标本获取仅需微创方法，比组织样本获取更具优势。但本研究发现，血浆hsa_circ_002059用于胃癌辅助诊断的AUCROC为0.626，但血浆外泌体检测未能区分胃癌患者与体检健康者，且组织学检测未能区分预后不良患者。因此，在辅助诊断中hsa_circ_002059的组织学检测效能优于血浆和血浆外泌体检测，而在预后评估中hsa_circ_002059的血浆检测效能则优于组织学检测。

此外，环状RNA被证实与miRNA具有结合位点，可作为miRNA分子海绵，参与胃癌等肿瘤的生长、转移过程。本研究发现，hsa_circ_002059具有多个胃癌相关miRNA的结合位点，可能通过miRNA分子海绵参与胃癌进展。进一步分析结果显示，在胃癌组织中低表达的hsa_circ_002059与肿瘤大小有关，在胃癌患者血浆中高表达与淋巴结转移有关，提示hsa_circ_002059与肿瘤进展相关。该分子在胃癌进展过程中的具体作用及机制有待进一步体内外实验证实。尽管有研究显示，环状RNA在组织与循环血液中的表达水平相一致[17]。但本研究证实hsa_circ_002059在胃癌组织与血浆中的表达水平相反，与Lu等[18]报道的hsa_circ_0006633表达情况相似，其内在的分子机制有待于进一步揭示，可能与环状RNA细胞分泌和清除机制有关。

综上所述，hsa_circ_002059表达与胃癌进展有关，组织学和血浆样本检测有望用于胃癌辅助诊断与预后评估。在后续研究中，我们将深入探讨其调控胃癌进展的作用和分子机制，并进一步扩大样本量，验证其对胃癌临床诊疗的潜在应用价值。