微波辅助提取水芫花多糖工艺研究

陈晓辉，吴泽吉，闻正顺

(1.浙江海洋大学食品与药学学院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大学海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022)

水芫花Pemphis acidula，又名海芙蓉，海纸钱鲁，原始花被亚纲，桃金娘目，千屈菜科；多为分枝小灌木，偶见小乔木状。水芫花提取物富含多糖、黄酮等物质，已被证实具有体外抗氧化[1]，抑菌[2]，抗炎[3]以及抗肿瘤[4]等多种生物学活性，其药用及保健价值正日益受到人们的关注。

植物类多糖因其具有提取方便，低毒性，高疗效等特点，近些年来，已经成为了炙手可热的课题[5-7]。研究发现，从水芫花中提取得到的多糖对不但有可以效缓解小鼠肠炎，还能够通过清除超阳离子自由基发挥体外抗氧化作用[8]，是一种极具潜力的活性物质，但常规方法下提取率较低。鉴于这个问题，本文通过单因素试验与响应面设计的方法，对水芫花多糖的微波辅助提取法进行了进一步优化，以期达到更高的提取率，为后续生物活性检验提供支持。

1 材料与仪器

1.1 材料

水芫花样品来源于西太平洋菲律宾海的帕劳群岛，经鉴定为水芫花属植物水芫花的枝干。

1.2 试剂与仪器

试剂：无水乙醇(货号：10009218)、三氯甲烷(货号：10006818)、正丁醇(货号：10005208)、苯酚(货号：10015318)、硫酸(货号：10021608)以及葡萄糖(货号：63005518)均购于国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

仪器：国家标准分样筛(60 目、40 目，和发筛网塑胶有限公司)、冷却水循环装置(CA-1111，上海爱朗仪器有限公司)、旋转蒸发仪(N-1100，上海爱朗仪器有限公司)、恒温水浴锅(HH-S，巩义市予华仪器责任有限公司)、恒温磁力搅拌器(Feb-85-2，常州国华电器有限公司)、中药粉碎机(103，瑞安市永历制药机械有限公司)、紫外-可见分光光度计(UV-1600，上海美谱达仪器有限公司)、循环水式多用真空泵(SHB-IIIA，河南省太康科教器材厂)。

2 试验方法

2.1 水芫花多糖的提取

水芫花枝干粉碎，60 ℃烘干，过40 目筛。精确称取水芫花粉末1.0 g，与蒸馏水混合，并按不同微波功率、提取时间利用微波辅助提取法进行提取。提取后抽滤，滤液进行蒸发浓缩。向溶液中加入1/5 体积的sevage 试剂(正丁醇与氯仿1：5)后室温下磁力搅拌1 h，分层弃蛋白。将去蛋白后的上清液进一步浓缩，加入95%的乙醇，4 ℃过夜。次日，离心去上清，得水芫花粗多糖。

2.2 多糖测定

2.2.1 葡萄糖标准曲线绘制

葡萄糖标准液浓度分别为0.00、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 与0.50 μg·mL-1，蒸馏水配制。取2 mL 标准液加入试管，1 mL 5%的苯酚溶液与5 mL 硫酸快速与之混合，室温振荡5 min。之后，沸水浴15 min 并冷却至室温。490 nm 处比色测定吸光度(A)并绘制标准曲线。纵坐标：吸光度(A)；横坐标：葡萄糖质量浓度(c)。求取回归方程。

2.2.2 多糖提取率的测定

适量粗多糖定容至100 mL，取2 mL 放入试管。处理方法同2.2.1。490 nm 处比色测定OD 值并根据葡萄糖标准曲线算出多糖质量浓度。提取率计算公式如下：

多糖提取率=[(c×D×V)/ M]×100%

式中：c 为样品液OD 值对照标曲方程所得多糖的质量浓度，mg·mL-1；D 为稀释倍数；V 为提取液的定容体积(100 mL)；M 为水芫花粉末的质量(1.0 g)。(每组3 个平行。)

2.3 提取工艺优化

2.3.1 不同提取时间与提取率的关系

取7 份水芫花粉末，每份1.0 g。固定料液比1：20(水芫花：蒸馏水=g：mL)；微波功率为200 W；按提取时间为2、4、6、8、10、12 和14 min 进行微波辅助提取，检测OD 值并计算多糖提取率。

2.3.2 不同微波功率与提取率的关系

水芫花粉末份数、质量与提取料液比同2.3.1，提取时间固定为8 min。按微波功率为100、150、200、250、300、350 和400 W 进行微波辅助提取，检测OD 值并计算多糖提取率。

2.3.3 不同料液比与多糖提取率的关系

水芫花粉末份数、质量同2.3.1，固定微波功率为200 W；提取时间为8 min；按料液比梯度：1：5；1：10；1：20；1：30；1：35；1：40；1：45(水芫花：蒸馏水=g：mL)进行微波辅助提取，检测OD 值并计算多糖提取率。

2.4 最佳工艺响应面优化

根据Box-Behnken的优化试验设计确定3 个考量条件参数，作为试验的变量，并设计3 水平响应面分析试验。试验变量：提取时间(A)、微波功率(B)、料液比(C)；响应值：水芫花多糖提取率(Y)。

3 结果与分析

3.1 葡萄糖标准曲线绘制

如图1 所示，葡萄糖标准曲线方程为：A=3.943 8c+0.095 3，R2=0.992 8。其线性有效范围为0～0.5 μg·mL-1。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Glucose standard curve

3.2 提取时间与多糖提取率的关系

图2 表明，当提取时间低于6 min 时，提取率随时间的增加呈现上升趋势，6 min 时上升至最大值9.52%。提取时间高于6 min 时，提取率有所下降，但下降趋势缓慢。可能是因为提取时间太长，细胞结构损伤程度加剧，对多糖造成一定的降解。因此响应面试验的提取时间0 水平点为6 min。

图2 提取时间与提取率的关系Fig.2 The relationship between extraction time and extraction rate

3.3 微波功率与多糖提取率的关系

图3 表明，当微波功率低于300 W 时，提取率随功率的增加而上升，300 W 时上升至最大值9.36%。考虑到微波功率高于300 W 时，提取率虽然有所下降，但变化不大；因此响应面试验的微波功率0 水平点为300 W。

图3 微波功率与提取率的关系Fig.3 The relationship betweenmicrowave power and extraction rate

3.4 料液比与多糖提取率的关系

如图4 所示，料液比低于1：35 时，提取率随料液比的加大而上升，分析原因可能与多糖饱和有关。而当料液比达到1：35 时，提取率上升至最大值9.03%。当料液比高于1：35 时，提取率有所下降，但下降趋势缓慢。通常多糖提取率与料液比大小成正相关，但微波穿透能力有限，随溶剂的增加微波不能良好地传递能量破坏细胞结构，因此多糖提取率也会受到一定影响。因此响应面试验的料液比0 水平点为1：35。

图4 液料比与提取率的关系Fig.4 The relationship between liquid-to-solid ratio and extraction rate

3.5 响应面优化设计与分析

3.5.1 响应面优化试验参数的确定

选取上文单因素试验结果中相应的考量条件，拟定响应面试验因素水平表1：

表1 响应面因素水平设计表Tab.1 Response surface factor level design table

3.5.2 响应面优化试验结果

根据表1，按照Box-Behnken 原理设计表2。

表2 Box-Behnken 试验设计和多糖产量Tab.2 Box-Behnken experiment design and polysaccharide yield

使用Design-Expert 软件对表2 数据进行二次回归拟合，建立回归方程：Y=10.07-0.17A+0.028B-0.036C+0.041AB-0.99AC-0.61BC-1.15A2-1.75B2-1.56C2其中：Y 为提取率。

3.5.3 响应面回归模型方差分析

由表3 可知，该回归模型对不同试验间的处理差异极显著(p＜0.000 1)，而失拟项不显著(p=0.406 3＞0.05)，说明是不确定误差造成了残差的产生，对实验结果不造成实质性的影响。R2=0.982 4，表明该模型具有较好的拟合度，R2Adj=0.959 7 与相关系数数值偏离度不大，C.V.=3.90%，变异系数很低，这些均表示该模型具有很好的准确度和真实性。由表中F 值和p 值的大小可知：提取时间最为影响对水芫花多糖的提取率，料液比和微波功率对其影响次之。

表3 响应面法对提取率的ANOVA 分析Tab.3 ANOVA analysis of extraction rate by response surface method

多糖提取率的因素显著率体现在p 值的大小上面，数据表明，A、B、C、AB 这些影响条件不体现对试验的显著影响；AC、BC、A2、B2、C2这些条件在实验中体现极其显著的影响，其p 值均小于0.01。由此可知一般的线性关系不能解释各单因素条件与水芫花多糖提取之间的关系，而是需要一种非线性的关系去解释。根据上文分析，响应面模型拟合度高，可以体现条件参数与响应值之间的实际情况，所以上述模型可用于对微波辅助提取水芫花多糖工艺的优化。

3.5.4 响应面图分析

为了更简单直白地了解各单因素条件与水芫花多糖提取率之间的交互影响，使用Design-Expert 软件对表3 数据进行并得到响应面图(图5)。曲面图中，该因素对多糖提取率影响越显著，其坡度就越大，反之同理。从等高线形状能看出影响水芫花多糖提取率的各条件交互作用的大小。交互效应越显著的因素间等高线形状越扁，反之交互效应不显著的因素体现在等高线图上则为圆形，间接近圆形说明交互效应不显著。

如图5(1)显示，在料液比为零水平时，响应值都随着微波功率和提取时间的变化先增大后减小，曲面的坡度较为明显，多糖提取率变化明显，然而呈偏向圆形的等高线图反映了微波功率与提取时间之间的交互作用对多糖提取率影响不显著。在图5(2)中，扁形的等高线图反映了提取时间与料液比的交互效应对的提取率呈显著影响，两个因素的影响大小为提取时间>料液比。图5(3)表明，提取时间为零水平时，微波功率与料液比变化，提取率先升高迟缓降低，在响应曲面中心达最高值，两者的交互作用显著。

图5 两交互因素对多提取率影响的响应面和等高线图Fig.5 Response surface and contour map of the influence of two interactive factors on multiple extraction rates

3.5.5 微波提取水芫花多糖的最佳优化条件的确定和验证实验

如表4，经Design Expert 软件分析给出的水芫花多糖提取工艺参数为：提取时间=5.84 min，微波功率=300.23 W，料液比=1：35.07 g·mL-1。理论提取率在此情况下为10.074 8%。考虑到试验的可行性，调整工艺参数为：提取时间=6 min，微波功率=300 W，料液比=1：35 g·mL-1。平行3 次试验得实际平均提取率为9.963 6%，相对误差为1.12%，因此响应面模型可用来指导水芫花多糖提取工艺。

表4 优化工艺实验值与预测值Tab.4 Optimize process experimental value and predicted value

4 讨论

天然植物多糖提取的常见方法包括水提沉法，超声波法以及微波辅助提取法等[9-10]；其中，微波辅助提取法作为一种新兴的提取方法，与传统提取法相比，具有更省时，耗能更少且纯度更高等特点[11-13]；辐射过程中，高频的电磁波可以在细胞内部快速产生高温，裂解细胞，促使物质被萃取[14]。多酚、果胶、皂苷等易分解的物质也常选用此方法来进行提取[15-17]。水芫花生长于热带，既具有真红树植物的结构特征[18-19]，又兼具半红树植物的生长特性[20-21]，现有研究表明，水芫花提取物具有多种生物学活性，尤其是水芫花多糖，不但含量丰富，而且具有诸如抗氧化，抗炎，肿瘤抑制等多种效用[22]，应用前景不容小觑。

响应面设计法是一种通过回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系来建立模型并分析试验各因素对结果影响程度的统计方法[23-24]，与传统统计学方法相比，响应面设计法具有精度较高，多项式函数能够在失效概率上收敛于真实的隐式极限状态函数的失效概率等特点[25]，已经被广泛应用于游离氨基酸提取，蔬菜脱水，工程菌提取发酵以及作物副产品发酵回收等多种领域的工艺参数优化[26-28]。本研究中，采用响应法对水芫花多糖微波辅助提取的工艺进行了优化，建立了芫花多糖提取率与提取时间、微波功率、料液比的二次回归模型。由该模型，确立了最优参数为提取时间6 min，微波功率300 W，料液比1：35 g·mL-1，在最优参数条件下，多糖提取率可以达9.963 6%，提高显著。同时，验证试验的相对误差仅为1.12%，说明此响应面模型准确、可靠，且具有良好的指导作用。综上，本试验不但为进一步深入研究水芫花多糖提供了参考依据，还为水芫花资源的开发及生物学活性探究提供了理论支持；为水芫花多糖在药物、食品等领域的进一步发展打下了坚实的基础。