小牛血清去蛋白注射液促进缺血皮瓣成活的实验研究

唐明杰 章程 贾亚超 孙玉强 柴益民

带蒂皮瓣移植技术是临床常用的修复肢体组织缺损的方法。当皮瓣切取面积超过血管蒂的供血范围时，常出现因缺血造成的皮瓣部分坏死，影响皮瓣移植效果[1]。因此，增加缺血皮瓣成活面积具有重要的研究意义[2]。小牛血清去蛋白注射液是目前治疗缺血性脑血管病的常用药物，受其可以减轻脑组织缺血再灌注损伤[3-4]和改善供氧、能量供应的启发，本研究以大鼠为实验对象，观察小牛血清去蛋白注射液对皮瓣缺血坏死及皮瓣成活面积的影响，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 缺血皮瓣模型建立

取雄性清洁级SD大鼠36只，4周龄，体质量300 g，由上海交通大学附属第六人民医院实验动物中心提供。经1%戊巴比妥(1 mL/100 g)麻醉成功后，在大鼠背部设计远端蒂随意皮瓣，长3 cm，宽10 cm，在深筋膜下将皮瓣掀起，彻底止血后使用4-0缝线将皮瓣缝回原处。

1.2 动物分组及处理

将上述大鼠随机分为3组，分别于术后当天经腹腔注射不同药物，每天1次，持续给药14 d。实验组给予不同浓度的小牛血清去蛋白注射液(奥德金，锦州奥鸿药业有限责任公司)，其中实验1组给予小牛血清去蛋白注射液30 mg/kg，实验2组给予小牛血清去蛋白注射液45 mg/kg，而对照组给予生理盐水。所有大鼠术后单笼饲养，正常进食和活动。

1.3 观察指标及检测方法

1.3.1 大体观察

术后14 d，根据皮瓣外观、质地、针刺后出血反应判断皮瓣成活情况。标记皮瓣坏死-成活界限，拍照后统计皮瓣存活及坏死面积，并计算皮瓣存活率。

1.3.2 组织学检查

术后14 d，对坏死边界组织取材并进行HE染色，观察皮肤组织结构，利用免疫组化染色(CD31、CD34、vWF)检测血管再生情况。将标本固定于10%福尔马林液，用石蜡包埋，切成 5 μm 厚的切片。于梯度酒精脱蜡至水，加入枸橼酸钠进行抗原修复，用抗CD31、CD34及vWF多克隆抗体进行标记，并用二氨基联苯胺(DAB)显色。于光学显微镜下检查，并比较各组结果。

1.3.3 凋亡基因及成血管基因检测

采用逆转录聚合酶链反应(PCR)技术检测凋亡基因BCL-2、BAX及成血管基因eNOS表达。在组织中加入1 mL Trizol试剂研磨彻底后，取上清。根据说明书指示提取总RNA。然后，取 1 μg RNA 样本用Amv逆转录酶与 oligo dt15 一起逆转录成 cDNA。使用 Power SYBR Green PCR Master Mix 试剂 (Invitrogen, USA)在 7 500 real time PCR 系统(ABI, Invitrogen, USA)完成实时定量 PCR 扩增，检测BCL-2、BAX、eNOS等相关基因。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 大体观察

所有SD大鼠均成活，无感染或死亡。术后14 d皮瓣坏死界限清晰，实验1组和2组皮瓣成活率分别为62.2%±6.3%和64.9%±3.5%，均显著优于对照组(47.8%±1.7%)(P<0.01)，其中实验1组与实验2组差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 组织学观察

HE和免疫组化染色显示，实验1组和2组皮肤结构及新生血管数量均明显优于对照组(图1)。定量分析显示，实验1组和2组新生血管标记物CD31、CD34、vWF密度显著高于对照组(P<0.01)，实验1组与实验2组CD31密度无统计学差异(P>0.05)，CD34及vWF密度差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

图1 HE及免疫组化染色(×200)

图2 免疫组化定量分析

2.3 相关基因检测

实验1组和2组凋亡指标BCL-2及BAX基因表达较对照组显著下调(P<0.05)，而3组成血管基因eNOS表达无显著差异(P>0.05) (图3)，提示小牛血清去蛋白注射液可以下调凋亡基因表达，但对血管指标基因表达无影响。

图3 BCL-2、BAX及eNOS基因检测

3 讨论

皮瓣移植是修复重建外科治疗软组织缺损的重要方法。尽管皮瓣外科学技术已较成熟，但当皮瓣切取面积过大或修复距离较远时，仍会出现皮瓣远端缺血坏死的现象，这也是皮瓣手术最常见的并发症。皮瓣移植后，皮瓣血运重建有多种途径，主要包括蒂部血管供氧、皮瓣内原有血管扩张、皮瓣内新生血管生成及受区基底和周边新生血管长入。当蒂部血管供血不足时，其他途径便成为皮瓣成活的重要因素。近年来已有多种方法如皮瓣延迟技术、全身或局部药物、细胞移植、生长因子、基因治疗、体外震波治疗等用于改善皮瓣手术后血供[5-8]。本研究采用小牛血清去蛋白注射液增加大鼠腹腔缺血皮瓣成活面积，为其临床应用提供了实验依据。

小牛血清去蛋白注射液改善脑及外周神经功能的作用及安全性已得到临床认可[4]。它是从发育旺盛的健康小牛血清中提取的一种生物活性物质，包含小分子激活肽、磷酸肌醇寡糖、氨基酸、脂类等。一般认为，前两者是其主要有效成分。在低氧条件下，细胞内的葡萄糖会发生无氧糖酵解，产生大量乳酸，乳酸会进一步影响细胞功能，加重细胞损伤。而磷酸肌醇寡糖则可以促进和改善组织细胞对葡萄糖的摄取利用，使葡萄糖利用由无氧酵解向有氧氧化转化，通过三羧酸循环和呼吸链产生大量能量，既增加了葡萄糖的利用率，又降低了代谢产物对组织的损害，为细胞修复和再生提供了良好条件[3]。李娟等[9]研究小牛血清去蛋白注射液对急性重型颅脑损伤患者脑脊液乳酸浓度的影响，结果显示治疗组乳酸含量从第3天开始出现明显下降，治疗组患者远期预后也优于对照组。

本研究显示，实验1组和2组皮瓣平均缺血坏死面积占比较对照组分别减小14.4%和17.1%，成活率较对照组分别提高了30.1%和35.8%；组织学检测表明，经小牛血清去蛋白注射液治疗后缺血皮瓣中有更多的新生血管生成；进一步的基因检测结果提示，小牛血清去蛋白注射液通过下调调亡基因表达，稳定内环境，而非通过直接上调成血管基因表达来发挥作用。这表明小牛血清去蛋白注射液在改善缺血皮瓣再生方面起着积极的作用。此结论与文献报道的小牛血清去蛋白注射液在脑梗塞治疗中起作用相辅[10]，即其可有效抑制炎症因子过度反应，降低机体损伤性反应，但对血管再生基因无明显调控作用。

综上所述，小牛血清去蛋白注射液可以通过下调缺血皮瓣凋亡基因表达，改善皮瓣缺血状态下细胞能量代谢，从而促进皮瓣新生血管生成，达到增加皮瓣成活面积的治疗目的。