血清微小RNA-155水平评估肺炎支原体肺炎预后的价值

李 敏，孙晓敏，赵二要，张 磊，董利利

(郑州大学附属儿童医院 河南省儿童医院 郑州儿童医院 1.呼吸科；2.普内一病区，河南 郑州 450000)

肺炎支原体肺炎(Mycoplasmapneumoniaepneumonia，MPP)是由肺炎支原体引起的肺部感染性疾病[1]。其中，难治性MPP(refractory MPP，RMPP)患儿病情危重，治疗难度大，严重时可引发心肌损伤、消化系统损伤等多种肺外并发症，对患儿的生命健康造成极大的威胁[2]。目前MPP的发病机制尚不明确，可能与免疫炎症损伤、T淋巴细胞亚群Th1/Th2失衡有关。现有研究[3-4]报道微小RNA-155(microRNA-155，miR-155)参与调控免疫应答、炎症反应及感染等多种生理过程，且与多种肺部疾病密切相关，因此推测miR-155可能也参与MPP的发生发展。但目前关于miR-155在MPP和RMPP中的研究报道尚不多见。因此，本研究拟通过检测MPP患儿外周血中miR-155表达水平，探讨miR-155在RMPP中的表达意义及与Th1/Th2平衡的相关性，为RMPP及RMPP合并肺外损伤的早期诊断及治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 资料来源 收集2016年12月—2019年6月在河南省儿童医院住院治疗的MPP患儿病历资料。纳入标准：①患儿体征、症状、胸部X线片及支原体抗体检测符合第8版《诸福棠实用儿科学》呼吸系统疾病中的MPP诊断标准[5]；②年龄<14岁；③入院前未进行类固醇激素治疗或大环内酯类抗生素治疗；④病历资料完整。排除标准：①既往患有支气管哮喘、反复呼吸道感染、慢性肺疾病或重症肺炎未痊愈者；②既往有先天性心脏病或肾、肝及神经系统慢性疾病者；③细菌、病毒及衣原体等其他原因引起的肺部感染。所有患儿家属均对本研究知情同意。

1.2 分组 患儿入院后接受标准大环内酯类抗生素治疗，并根据RMPP标准[6](经大环内酯抗生素正规治疗7 d以上，临床征象加重，仍持续发热，肺部影像学显示加重等)分为普通MPP组和RMPP组。再根据住院期间是否发生肺外损伤，将RMPP患儿分为肺外损伤组和无肺外损伤组。

1.3 方法

1.3.1 临床资料 统计患儿年龄、性别、热程、热峰等一般临床资料。

1.3.2 实验室指标 患儿入院24 h内采集外周静脉血5 mL送检验科，①采用全自动五分类血液分析仪检测白细胞计数(WBC)和中性粒细胞比例(N%)，采用Westergren法测定红细胞沉降率(ESR)，采用免疫比浊法测定C反应蛋白(CRP)，采用全自动生化分析仪检测乳酸脱氢酶(LDH)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)。②采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)水平，并计算IFN-γ/IL-4比值。③采用qRT-PCR检测外周血浆中miR-155的表达水平，以U6为内参。

1.3.3 影像学检查 对所有患儿进行肺部CT或X线检查，确定肺部病变情况，包括病变部位(双侧或单侧)及有无胸腔积液、肺实变等。

2 结果

2.1 基本情况 2016年12月—2019年6月在河南省儿童医院住院治疗的MPP患儿共136例。普通MPP组80例，RMPP组56例；RMPP患儿中肺外损伤组25例，无肺外损伤组31例。

2.2 普通MPP与RMPP一般资料及实验室指标比较 两组患儿一般资料及实验室指标比较结果显示，RMPP组热程、WBC、N%、ESR、CRP、LDH、AST、ALT、IFN-γ、IL-4、miR-155水平以及影像学胸腔积液、肺实变的发生比率均高于普通MPP组，IFN-γ/IL-4低于普通MPP组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 普通MPP与RMPP组患儿一般临床资料及实验室指标比较

2.3 RMPP患儿miR-155水平与Thl/Th2及炎症指标的相关性分析 相关性分析结果显示：RMPP患儿miR-155水平与IFN-γ/IL-4比值呈负相关(r=-0.307，P<0.05)，与ESR、CRP、WBC呈正相关(r值分别为0.273、0.409、0.322，均P<0.05)，与其他指标无相关性(均P>0.05)。见表2和图1。

图1 RMPP患儿miR-155与Thl/Th2及炎症指标的相关性

表2 RMPP患儿miR-155与Thl/Th2及炎症指标的相关性分析

2.4 RMPP患儿多因素logistic回归分析 以患儿是否为RMPP为因变量，纳入表1中有差异的指标(热程、WBC、N%、ESR、CRP、LDH、AST、ALT、IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4、miR-155、影像学胸腔积液、肺实变，连续变量按照中位值转化为二分类变量)为自变量，进行多因素logistic回归分析，结果显示热程、CRP、LDH、IL-4、miR-155、胸腔积液及肺实变是RMPP的独立危险因素(均P<0.05)。见表3。

表3 RMPP患儿多因素logistic回归分析

2.5 miR-155对RMPP的诊断价值 采用ROC曲线分析miR-155对RMPP的诊断价值，结果显示：miR-155诊断RMPP的曲线下面积(AUC)为0.742，尤登指数为0.411，最佳截断值为1.2，特异度和灵敏度分别为78.57%、62.50%，提示miR-155对RMMP具有一定的诊断价值。见图2。

图2 miR-155鉴别普通MPP和RMPP的ROC曲线分析

2.6 RMPP患儿是否合并肺外损伤的一般及临床资料对比 合并及非合并肺外损伤RMPP患儿的一般资料及实验室指标比较结果显示，肺外损伤组患儿WBC、N%、ESR、CRP、IL-4、miR-155水平以及影像学肺实变的发生比例均高于无肺外损伤组患儿，IFN-γ/IL-4低于无肺外损伤组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表4。

表4 RMPP合并肺外损伤组与非合并肺外损伤组患儿资料比较

2.7 RMPP合并肺外损伤患儿miR-155水平与Thl/Th2及炎症指标的相关性分析 相关性分析结果显示：RMPP合并肺外损伤患儿miR-155水平与Thl/Th2及炎症指标无相关性(均P>0.05)。见表5。

表5 RMPP合并肺外损伤患儿miR-155与Thl/Th2及炎症指标的相关性分析

2.8 RMPP合并肺外损伤患儿多因素logistic回归分析 以RMPP患儿是否合并肺外损伤为因变量，纳入表4中有差异的指标(WBC、N%、ESR、CRP、IL-4、IFN-γ/IL-4、miR-155、肺实变，计量资料按照中位值转化为二分类变量)为自变量，进行多因素logistic回归分析，结果显示N%、IL-4、miR-155是RMPP合并肺外损伤的独立危险因素(均P<0.05)。见表6。

表6 RMPP合并肺外损伤患儿多因素logistic回归分析

2.9 miR-155对RMPP肺外损伤的诊断价值 miR-155对RMPP肺外损伤诊断价值的ROC曲线分析结果显示：miR-155诊断RMPP肺外损伤的AUC为0.724，尤登指数为0.470，最佳截点值为1.41，特异度和灵敏度分别为76.00%，70.97%，提示miR-155水平对RMMP肺外损伤具有一定提示意义。见图3。

3 讨论

目前MPP的发病机制尚不明确，但研究[7]均认为免疫炎症反应及免疫失衡与MPP的发生、发展相关。近年研究[8]发现miRNA在调控多种疾病的免疫应答反应及相关炎症因子的表达上发挥重要的作用。miR-155是典型的多功能miRNA之一，可参与B淋巴细胞和T淋巴细胞的应答过程，在CD4+、CD25+、Th1等T淋巴细胞的免疫抑制反应中发挥重要作用，参与肺炎的发生、发展。但目前关于不同类型肺炎的研究结果不一[9-10]。陆荣耀等[11]研究发现miR-155在反复肺炎婴幼儿血清中高表达，是影响婴幼儿反复肺炎发生的独立危险因素。但Yang等[12]研究表明，miR-155在肺炎患者支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中低表达。张薇等[13]研究表明，miR-155在MPP患儿外周血中高表达。因此，关于miR-155与肺部感染性疾病中的水平仍需进一步研究。本研究结果显示RMPP患儿外周血miR-155水平显著高于普通MPP，且是RMPP的独立危险因素，与大部分研究[14-15]结果一致。同时ROC曲线分析显示miR-155对RMPP的诊断具有较高的灵敏度(62.50%)和特异度(78.57%)，提示miR-155对RMPP具有一定的诊断价值。

CD4+、CD25+及CD8+等T淋巴细胞在肺炎支原体感染后的免疫炎症反应中扮演重要角色。其中，CD4+按其细胞因子和生物功能的不同可分Th1和Th2两种，Th1分泌IFN-γ因子，而Th2细胞分泌IL-4因子，因此通常用IFN-γ/IL-4比值来代表机体Th1/Th2细胞优势状态。正常条件下Th1/Th2细胞处于动态平衡，以维持机体正常的免疫功能。Th1/Th2的失衡与肺炎、肺结核及MPP等多种肺部炎症疾病的发生、发展密切相关[16-18]。现有研究[19-20]已证实不同类型不同病情的MPP患儿在Th1/Th2免疫应答上存在差异。李菁等[21]研究发现高菌量MPP患儿BALF中IL-4水平和IL-4/IFN-γ明显高于低菌量患儿，说明MPP患儿BALF中高菌量可诱导Th2免疫炎症因子产生，导致Th1/Th2免疫偏移。康妍萌等[22]研究发现重度MPP患儿BALF和血清中IL-4/IFN-γ比值均显著高于支气管异物患儿，说明严重MPP患儿中存在Th1/Th2失衡。本研究结果显示，RMPP患儿IFN-γ、IL-4水平明显高于普通MPP患儿，IFN-γ/IL-4明显低于普通MPP患儿，提示Th1和Th2细胞免疫反应可能参与RMPP的发病过程，与现有研究结果基本一致。有证据显示MPP患儿外周血miR-155水平与Th1/Th2、CD3+、CD8+等淋巴细胞水平呈负相关，与炎症因子呈正相关，推测miR-155对T淋巴细胞亚群的调控可能是其参与炎症疾病的机制。本研究结果发现RMPP患儿中miR-155与Th1/Th2呈负相关，与CRP等炎症指标呈正相关，因此推测miR-155可能通过影响T淋巴细胞及炎症因子水平影响细胞免疫反应，进而参与RMPP的发病过程中。

国内外研究[23]报道，50%以上的MPP患儿会合并肺外损伤，包括消化系统、心血管系统、血液系统及泌尿系统损伤等，其中RMPP患儿肺外损伤发生率明显高于普通MPP患儿。但目前关于RMPP合并肺外损伤的发病机制尚不明确，其可能与肺炎支原体直接作用、炎性介质引起的自身免疫功能失调有关。近年来研究[24-25]表明miR-155与肺部疾病合并肺外损伤的发生有关，但miR-155在RMPP合并肺外损伤中的作用尚不清楚。因此本研究分析了RMPP合并和不合并肺外损伤患儿的miR-155水平，结果显示，RMPP肺外损伤患儿miR-155水平明显高于无肺外损伤组，且是RMPP合并肺外损伤的独立危险因素，提示miR-155与RMPP合并肺外损伤的发生密切相关。同时ROC曲线分析显示miR-155对RMPP合并肺外损伤的诊断具有较高的灵敏度(70.97%)和特异度(76.00%)。因此，miR-155可能成为RMPP早期治疗和预防RMPP患儿肺外损伤发生的新的标志物和潜在靶点。但本研究相关性分析显示，肺外损伤患儿的miR-155水平与Th1/Th2指标无相关性，推测miR-155可能不是通过Th1/Th2平衡参与肺外损伤的发生，其引起肺外损伤的机制仍需进一步研究才能获取确切结论。

综上所述，本研究认为miR-155在RMPP患儿外周血中高表达，与患儿Th1/Th2平衡密切相关，对RMPP诊断及合并肺外损伤的早期识别具有一定的预测价值。但本研究为小样本单中心研究，应用于临床还有一定局限性，因此还需临床工作者进一步扩大样本量进行多中心研究。