QuEChERS-液质联用技术同时测定大米中的4种真菌毒素及5种农药残留量方法的研究

蒋林惠，陈 彬，周易枚，杨 俊，周 楠，陈 煜

南通市食品药品监督检验中心 (南通 226000)

我国大米中真菌毒素和农药残留量的情况一直以来都受到多方面的关注，日常监督检验过程中这两类污染物时有检出[1-2]，因此监测大米是否受到真菌毒素和农药残留的污染，对于保证大米的质量安全具有非常积极的意义。

真菌毒素目前的国标检测方法主要有：液相色谱串联质谱法、液相色谱法、酶联免疫吸附法、薄层色谱法等。农药残留量的国标检测方法有气相色谱法、气质联用法、液相色谱法、液质联用法等[3]。目前，我国现行的真菌毒素及农药残留量的相关检测标准仅单独测定其中一类污染物，未有真菌毒素和农药残留同时检测的标准。为此，建立一种适用于大米等粮谷中多种真菌毒素和农药残留量同时检测的方法，对于在实际检测中提高效率、节约成本十分重要。本文基于QuEChERS前处理技术，根据实验材料及目标化合物进行方法改进，建立一种液质联用技术同时测定大米中4种真菌毒素和5种农药残留量的高通量检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

大米：购自农贸市场。

主要仪器：Thermo Vanquish-TSQ Altis型液质联用仪，赛默飞世尔科技；Milli-QReference型超纯水器，密理博上海公司；氮吹仪，biotage/瑞典；电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；涡旋振荡器，赛默飞世尔科技；研磨机，IKA。

主要试剂：甲醇(默克，色谱纯)、乙腈(默克，色谱纯)、甲酸(阿拉丁，色谱纯)、乙酸铵(国药，色谱纯)，无水硫酸镁(安谱，>98%)，氯化钠(安谱，优级纯)，C18(安谱)。

标准物质：吡虫啉(BePure，1 000 μg/mL)、阿维菌素(BePure，1 000 μg/mL)、嘧菌酯(BePure，998.2 μg/mL)、戊唑醇(BePure，998.7 μg/mL)、肟菌酯(BePure，999.7 μg/mL)、黄曲霉毒素B1(First Standard，100 μg/mL)、13C17黄曲霉毒素B1(Romer，0.5 μg/mL)、T-2毒素(First Standard，100 μg/mL)、玉米赤霉烯酮(安谱，50 μg/mL)、赭曲霉毒素A(First Standard，10 μg/mL)，以上标准物质均为溶液型。

1.2 标准溶液的配制

购入的标准储备液，用甲醇∶乙腈(1∶1，v/v)稀释并配制中间浓度的标准工作液1 μg/mL(其中玉米赤霉烯酮为10 μg/mL)，于4 ℃下避光保存。根据需要用基质提取液逐级稀释，配制成适当浓度的混合标准工作液，现配现用。

1.3 方法

1.3.1样品前处理方法

样品粉碎后过20目筛，准确称取粉碎均匀的样品粉末5.00 g(精确到0.01 g)，置于50 mL塑料离心管中，加入20 mL乙腈-水-甲酸(84∶15∶1，v/v/v)，涡旋振荡3 min，超声20 min，浸泡过夜(-18 ℃)；加入4 g无水MgSO4，1 g NaCl，涡旋2 min，10 000 r/min离心10 min。取5 mL上清液，加入100 mg C18，涡旋2 min，-18 ℃冷冻2 h，10 000 r/min离心10 min，取上清液3 mL，经40 ℃氮吹浓缩近干，加入初始流动相1 mL复溶，涡旋1 min，上清液过0.22 μm滤膜，LC-MS/MS测定。

1.3.2检测条件

1.3.2.1 色谱条件

色谱柱，Accucore Aq，150 mm×2.1 mm，2.6 μm；流动相，A为5 mmol乙酸铵0.1%甲酸水，B为甲醇乙腈(甲醇∶乙腈=1∶1，v/v)，梯度洗脱；流速0.3 mL/min；柱温35 ℃；进样体积2 μL。梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱比例

1.3.2.2 质谱条件

离子源，电喷雾离子源(ESI)；扫描方式，正离子模式；扫描模式，SRM多反应监测扫描；离子源电压3 500 V；离子传输管温度300 ℃；蒸发温度400 ℃；鞘气35(Arb)；辅助气8(Arb)；反吹气0(Arb)。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的优化

测定真菌毒素和农药残留，流动相通常由水和有机溶剂(如甲醇、乙腈)等组成[4]，流动相的选择关系到样品的分离度和离子化效果，也会对化合物在质谱检测的信号响应值产生影响[5]。

为提高药物目标化合物的电离度，得到更好的灵敏度[6]，试验对比了5 mmol乙酸铵0.1%甲酸水-甲醇乙腈溶液(其中甲醇∶乙腈=1∶1，v/v)、5 mmol乙酸铵0.1%甲酸水-甲醇溶液、5 mmol乙酸铵0.1%甲酸水-乙腈溶液、甲醇-水、乙腈-水5套体系，流动相选择梯度洗脱，调节有机相比例使液相条件最佳。结果表明，流动相中加入0.1%甲酸及5 mmol乙酸铵能有效促进目标物的电离，并且有利于改善目标物的峰形。而甲醇-水、乙腈-水作为流动相时，赭曲霉毒素A的峰形展宽；而加入甲酸的流动相，9种污染物均能得到较好的峰形[2]。另外，乙腈甲醇(1∶1)的有机相使得真菌毒素的分离和峰形效果较好。另外，根据色谱柱的柱长、内径、填料粒径，本实验选择0.3 mL/min的流速。

2.2 质谱条件的选择

本实验测定的9种物质(包含黄曲霉毒素内标)，根据其化学性质，均采用ESI+模式进行扫描。应用仪器自带的工作站TSQ自动优化质谱参数，首先采用母离子扫描模式，根据质荷比确定母离子设置合适的离子源电压，离子传输管温度，蒸发温度，鞘气、辅助气、反吹气的气流量，确保每个物质都能获得较好的相应。再进行SRM优化，优化子离子、碰撞能量、透镜电压。定量离子、定性离子的选择参照相关标准。最终建立10种物质的多反应检测扫描(SRM)方法。本实验中涉及的化合物的SRM详细信息见表2。

表2 9种真菌毒素和农药残留质谱条件

2.3 样品提取与净化

大米粉的含水量较低，提取溶液需加入一定比例的水相以提高目标化合物的提取率[7]。乙腈对于农药和真菌毒素均有良好的溶解性[5]，故选其作为提取液的有机相。提取液加入适量的甲酸，能够有效提取对酸度和极性较为敏感的真菌毒素和农药残留物质[8]。

本实验中考察提取液乙腈-水-甲酸(84∶15∶1，v/v/v)、乙腈-水(84∶16，v/v)两种提取溶液对9种药物的回收率和提取效果，并通过基质匹配的外标法进行计算(其中黄曲霉毒素B1选择内标法进行定量计算)。

本实验乙腈-水提取液进行提取时，赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1的回收率较低，乙腈-水-甲酸提取液进行提取时，9种污染物的回收率能够符合60%～120%的规定[9]。

盐析剂的作用是促进水相和有机相的分层，使得待测物进入到有机相中，从而提高提取效率[10]。本实验中采用经典的盐析剂品种和配比：4 g无水MgSO4，1 g NaCl。而净化过程是一个除去提取液中杂质并保证目标化合物回收率的一个过程。通常考虑采用C18、PSA进行待测溶液净化。C18对长链脂类物质、甾醇等非极性的干扰物有良好的吸附效果，而PSA因其特殊结构易与酸性真菌毒素(如赭曲霉毒素A)分子上的羧基反应，影响其回收率。故在该实验中选择C18100 mg作为净化试剂。

2.4 方法的线性范围和定量限

本实验选择空白基质提取液匹配标准曲线进行定量，减小基质效应对于准确度的影响。用大米基质空白配制4种真菌毒素和5种农药残留的混合标液，质量浓度依次为10、20、50、100、150、200 μg/L；其中玉米赤霉烯酮为100、200、500、1 000、1 500、2 000 μg/L。结果表明，当质量浓度为10～200 μg/L(ZEN：100～2 000 μg/L)，9种药物的回归曲线的决定系数(R2)在0.995～0.999以上，线性关系良好。开展大米空白样品添加试验，以10倍信噪比时的添加浓度为方法定量限，结果如表3所示，9种药物的定量限在5 μg/kg(AFT-B1可将定量限降低至0.1 μg/kg)，玉米赤霉烯酮50 μg/kg。

表3 9种真菌毒素及农药残留的线性及方法定量限

2.5 精密度和回收率

称取不含9种真菌毒素和农药残留的大米样品，添加混合标样，添加浓度(质量分数)分别为10、50、100 μg/kg，每个水平做3次平行。结果显示，9种药物的平均回收率为62.8%～98.1%，精密度为2.3%～13.5%(表4)。

表4 9种真菌毒素及农药残留回收率及精密度 %

3 结论

通过本文的实验研究，建立起基于QuEChERS-液质联用检测技术的大米中4种真菌毒素和5种农药残留的快速检测方案。该方法高效、准确、集约，适用于大米中吡虫啉、阿维菌素、嘧菌酯、戊唑醇、肟菌酯、赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、T-2毒素等9种药物的定性定量快速检测，能够为大米中主要真菌毒素和农药残留的快速高通量筛查提供一定的技术支持。