革兰氏阳性与阴性细菌RNA提取方法的比较与优化

云飞 夏婷 石雅丽 雷鹏

摘要：RNA 是除DNA外的存储遗传信息的主要载体。随着分子生物学技术的发展，提取高纯度和完整性的RNA是微生物分子生物学研究的必要前提。RNA提取的本质就是破碎细胞壁，释放细胞内部的RNA，利用不同试剂去除多糖、脂类、蛋白以及DNA 等杂质，最终获得高纯度、高质量的RNA。本实验选择总RNA提取试剂盒和改良Trizol法对大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的RNA进行提取，并对结果进行分析。

关键词：革兰氏阳性细菌;革兰氏阴性细菌;RNA提取;改良Trizol法;

引言

RNA是在蛋白质生物合成、生物进化和基因表达中起重要作用的遗传信息载体。RNA提取是分子生物学研究中的重要试验，在反转录、cDNA文库建立、蛋白质体外翻译中对RNA的要求很高[1]。RNA的提取方式多种多样，RNA的完整性和纯度都会因不同提取方式而有所不同。常用的RNA提取方法有：CTAB（十六烷基三甲基溴）法[2]、热硼酸法[3]、SDS-Phenol（十二烷基磺酸钠-苯酚）法[4]，Trizol法[5]等。本实验以商品化的总RNA提取试剂盒为对照，对Trizol法进行改良，以大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为实验材料提取RNA，目的是获得操作简单，并且可以大量提取RNA的方法。

1. 常用RNA提取方法

RNA提取的本质就是破碎细胞壁，释放细胞内部的RNA，利用不同试剂去除多糖、脂类、蛋白以及DNA 等杂质，经过一系列的相关操作，最终获得高纯度、高质量的RNA的过程。常用的RNA提取方法有：CTAB法、强变性剂法、热硼酸法、SDS-Phenol法，Trizol法等。

1.1 CTAB法

CTAB与β-巯基乙醇混合后，可使蛋白质的结构和性质发生改变，从而RNA酶的活性降低。CTAB提取法刚开始被广泛的应用到提取植物的DNA，之后为提取RNA所用，该方法可除去提取RNA过程中可能影响RNA质量的一些物质，再进行洗涤沉淀，将RNA沉淀出来，达到提取RNA的目的。这种方法提取RNA的过程简捷，提取成本不高。

1.2强变性剂法

强变性剂法的特点是在RNA提取液中存在蛋白强变性剂，这种蛋白质强变性剂能很好的降低RNA酶对RNA的影响，这种方法可以提取大量的细菌总RNA。异硫氰酸胍、盐酸胍以及饱和酚等物质是蛋白强变性剂且这些物质不仅能让RNA酶的活性降低，也可以成功地使核蛋白和核酸的结合物分解，在β-巯基乙醇和N-月桂酰肌氨钠混合之后，其作用可以让RNA酶的活力降低。

曾有科学家尝试用变性剂来溶解细菌的细胞膜 [6～7]，成功的从微生物中提取到了mRNA。有研究者通过实验来比较不同成分的裂解液对RNA提取效果的影响，结果表明，添加4 mol/LGuscn做变性剂能够有效的阻碍RNA降解，同时使RNA酶的活性降低，提高所提取的RNA的质量[8]。异硫氰酸胍作强变性剂来提取RNA，提取RNA所需的时间长，不适用于大量样品的提取。

1.3 SDS-Phenol法

SDS能很好地使核蛋白與核酸结合体分解，还可以与有机溶剂苯酚等物质一起混合使用。SDS-phenol法可以在使RNA酶活性降低的同时，使蛋白质的结构和性质发生改变等。吴丽娟等[4]改良了SDS-Phenol法，这种方法提取细胞总RNA耗时少，速度快。Jahn等人通过热SDS-phenol法提取到了质量较高，纯度较高的微生物RNA，提取到的RNA用于基因表达的研究[9]。该方法所提取到的RNA纯度较高且完整性好，是一种步骤简捷、耗时少且高效提取RNA的方法。

1.4 热硼酸法

硼酸和酚类相结合构成结合物，这类结合物可以防止菌体本身所携带的酚影响到所要提取的RNA，并且这类结合物可以和RNA再结合。在某些特殊离子的作用下，可以使菌体内的糖、酚类物质分离并使其沉淀，从而达到提取RNA的目的。热硼酸盐法提取RNA的时间短，提取过程简单。

deSaizieu[10]和Selinger[11] 用热酚法提取RNA，在60℃～ 65℃的温度下，细胞的溶解速度非常快，而且RNA酶不会影响到RNA的提取。还有一种较为简便的提取RNA方法，使用温度适宜的阻断液，该溶液可以让RNA不受影响，之后用溶菌酶使细菌裂解，最后用热酚和氯仿提取RNA。使用比较多的稳定总RNA是RNA Later溶液（Ambin and Qiagen）和RNAprotectBacteria Reagent（Qiagen），这种溶液的优点是可以快速稳定mRNA 群体，使细胞在未提取RNA前，在适当的条件下mRNA存活更长时间。

2. 本实验提取RNA的方法

2.1 供试菌株

大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。大肠杆菌属于革兰氏阴性细菌，枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性细菌。

2.2试剂与仪器

（1）试剂：Trizol试剂，氯仿，75%的乙醇，无RNA酶水。

（2）器材：移液枪，无核酸酶枪头，超净台，1.5ml无核酸酶离心管，离心机，水浴锅，微波炉。

2.3试验方法

2.3.1 Eastp®Super总RNA试剂盒提取微生物RNA

Eastp®Super总RNA试剂盒可以从动植物组织、培养的细胞和细菌内提取总RNA，它是通过离心柱膜来快速提取RNA。

（1）操作步骤

取1.5ml菌液（12h，37℃，200rpm培养），提取RNA操作步骤参见试剂盒说明书。提取后，加入30μl无RNA酶水。电泳检测RNA质量，1.5%琼脂糖凝胶，6μl Marker，2μl RNA，电泳电压150V，5min，凝胶成像仪拍照。

（2）实验结果

利用Eastp®Super总RNA试剂盒提取两种细菌RNA的凝胶成像图如下（图1）。

（3）结果分析

由图1可以看出：这种试剂盒提取出来的RNA质量高，完整性好，没有蛋白质和基因组DNA的污染。但一次只能处理1-2ml菌液，处理菌液量有限，对于提取大量菌液的RNA不合适。其中图1中的4号泳道在电泳时没有加样1，可能是旁边泳道的样品飘样过来的。

2.3.2 Trizol法提取微生物RNA

Trizol是一种总RNA提取试剂，它是以 “硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法”（简称“一步法”）为基础的RNA提取试剂，这种试剂提取RNA的速度快，效率高，提取出没有污染的RNA质量高、产量大。

（1）实验步骤

1）各取1.5ml的菌液，以转速为10000×g，时长2min离心。去除上层液体，留沉淀。在含有菌体沉淀的离心管中添加200μl溶菌酶溶液（浓度为3mg/ml），静置1min;

2）往管中加入1ml的Trizol试剂，轻轻弹动，让沉淀悬浮试剂中，静置5min。

3）加400μl的氯仿，使之混合，以转速为10000×g，时长5min离心。

4）吸取上层清液500μl置于干净的离心管内，再添加1ml的无水乙醇，于零下20℃的环境中放置2-3min。

5）放置结束后，以转速为10000×g，时长10min离心，去除上层清液，干燥2-3min，加入30μl无RNA酶水。

提取后，电泳检测RNA质量，1.5%琼脂糖凝胶，6μl Marker，2μl RNA，电泳电压150V，5min，凝胶成像仪拍照。

（2）实验结果

Trizol法提取两种细菌RNA的凝胶成像图如图2。

2.3.3 改良Trizol法提取微生物RNA

（1）操作步骤

1）各取1.5ml的菌液，调节离心机的转速为10000×g，时长2min进行离心。去除上层液体，留下菌体沉淀。在含有菌体沉淀的离心管里添加200μl溶菌酶溶液（浓度为3mg/ml）

2）在有混合液的离心管中添加1ml的Trizol试剂。

3）向混合液中添加200μl的氯仿，上下轻轻摇晃，使之混合，10000×g，时长10min离心。

4）吸出上层清液500μl放于其他的离心管内，再向内 添加2倍体积的无水乙醇10000×g，时长5min离心，去除上层清液，再干燥2-3min。加入30μl无RNA酶水。

电泳检测RNA质量，1.5%琼脂糖凝胶，6μl Marker，2μl RNA，电泳电压150V，5min，凝胶成像仪拍照。

（2）实验结果

改良Trizol法提取两种细菌RNA的凝胶成像图如图2。

（3）结果分析

实验结果如图2所示，用Trizol法提取到的RNA条带清晰、整齐、干净，没有蛋白質和基因组DNA的污染;而用改良Trizol法提取的2种细菌RNA，不仅RNA条带清晰、整齐、干净，没有蛋白质和基因组DNA的污染，而且RNA的量较大。

3 展望

本实验所用的大肠杆菌Escherichia coli和枯草芽孢杆菌Staphylococcus aureus分别属于革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌，前者细胞壁肽聚糖较薄，易于破壁，后者细胞壁肽聚糖较厚，不易破壁。总RNA试剂盒也能很快提取到RNA，提取时间为1h左右，而且试剂盒内提供的试剂中有能使RNA酶活性降低的物质，可以减少RNA降解。用这种方法提取的RNA的质量好、有较好的完整，纯度也高。但是产物量少，大量提取时成本较高。用Trizol法能提取出的细菌RNA，RNA质量较好，纯度较高，但是产物量少。改良Trizol法可以很快速提取出细菌RNA，不仅质量好、纯度高、产量高，而且可以大量获得细菌RNA，所以本实验摸索的改良Trizol法达到了预期效果。

参考文献：

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[11] Jeffrey WH， Nazaret S， Haven RV. Improved method for recovery ofmRNA from aquatic samples and its application to detection of merexpression. Appl Environ Microbiol， 1994， 60 ： 1814～1821.

作者简介：云飞（1981年9月-），男，蒙古族，内蒙古土左旗人，博士，讲师，研究方向为基因工程。

通讯作者：石雅丽，（1981年10月-），女，汉族，内蒙古正蓝旗人，博士，讲师，硕士生导师，研究方向为基因工程。

基金项目：此文由2020年内蒙古自治区自然科学基金面上项目，项目名称：来源于蒙古牛瘤胃的坚硬芽孢杆菌降解纤维素机理的研究，项目负责人：石雅丽，项目编号：No. 2020MS03030

由2015年内蒙古工业大学科学研究项目，项目名称：海拉尔赋煤区煤系共生锗赋存规律，项目负责人：云飞，项目編号：No. ZD201524

由2017年内蒙古工业大学科学研究项目，项目名称：基于瘤胃微生物组学中纤维素酶的研究，项目负责人：石雅丽，项目编号：No. ZD201703 。