藁本内酯对神经干细胞/祖细胞的增殖作用及机制研究

王 敏 ，Hideki Hayashi，刘建勋，Norio Takagi*，任钧国

1.中国中医科学院 西苑医院基础医学研究所，北京 100091

2.东京药科大学 应用生化研究室，东京 192-0392

藁本内酯为川芎和当归中的内酯类化合物[1]，具有抗炎、抗氧化应激[2]、改善学习记忆[3]、保护血脑屏障[4]、保护神经元[5]、抗肿瘤[6]等药理作用。中医理论记载，川芎能够“上行头目”，且川芎为临床治疗脑缺血处方中常见配伍药味之一，藁本内酯为川芎挥发油中含量较大的成分[7-8]。研究显示，大鼠po藁本内酯后，其在脑中的分布较其他组织中多，表明藁本内酯具有较好的脑靶向性[9]，在治疗脑相关疾病中具有潜在的优势。

脑缺血后，由于溶栓不及时，瘫痪、偏瘫、失语以及学习记忆障碍等神经损伤症状为脑缺血常见的后遗症，严重影响患者的生活质量和寿命，目前尚无公认的针对缺血后神经修复治疗的制剂上市。神经干/祖细胞（neural stem/progenitor cells，NS/PCs）的增殖对于脑缺血后神经元的修复、神经网络的重构以及后期神经功能的恢复至关重要[10]。本课题组前期研究发现川芎提取物对脑缺血后大鼠体内的神经祖（母）细胞具有增殖作用[11]，本研究拟在此基础上考察川芎中的主要活性成分藁本内酯对体外NS/PCs的增殖作用。

1 材料

1.1 动物

孕14 d Wistar大鼠购自日本SLC公司，饲养于（23±1）℃、湿度（55±5）%的环境中，自由进食饮水。动物实验经东京药科大学动物伦理委员会批准（批准号P20-02）。

1.2 药品与试剂

藁本内酯对照品（质量分数为86%，批号111737-201608）购自中国食品药品检定研究院；β-actin抗体（批号A5441）、Vimentin抗体购自美国Sigma公司；Hank’s平衡盐溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS，批号14175-095）、DMEM/F12培养基（批号11320-033）、B27因子（批号17504-044）购自美国Gibco公司；Accutase细胞消化液（批号A11105-01）、Alexa Fluor 488标记亲和纯化山羊抗兔IgG抗体（批号A11037）、Alexa Fluor 594标记亲和纯化山羊抗鼠IgG抗体（批号A11029）购自美国Invitrogen公司；DNase I（批号LK003170）购自美国Worthington Biochemical公司；100×双抗（批号168-23191）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF，批号059-07873）、D-PBS（批号045-29795）购自日本Wako公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，批号166717）、Percoll细胞分离液（批号17-0891-02）购自美国GE Healthcare公司；神经细胞培养添加剂N2 MAX Media Supplement（批号AR009）购自美国RD System公司；成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF，批号031908）购自美国Peprotech公司；磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）抗体（批号4060S）、Akt抗体（批号2920S）、磷酸化糖原合成酶激酶（phosphorylated glycose synthase kinase 3β，p-GSK3β）抗体（批号5558S）、GSK3β抗体（批号9315S）、active-β-catenin抗体（批号8814S）、β3-tubulin抗体（批号5741S）、β-actin抗体购自美国CST公司；WST-1检测试剂（批号346-06454）、Hoechst细胞核染料（批号346-07951）购自日本DojinDo公司；HRP标记的二抗购自美国Pierce Biotechnology公司。

1.3 仪器

培养瓶（美国Thermo Fisher Scientific公司）；解剖显微镜（日本Olympus公司）；6200型离心机（日本Kobota公司）；电泳仪（美国Bio-Rad公司）；细胞过滤器（美国Falcon公司）。

2 方法

2.1 原代大鼠NS/PCs的分离培养

取孕14 d大鼠，脱颈椎处死，腹部以75%乙醇消毒，快速打开腹腔，取出子宫，以预冷的HBSS溶液清洗2次，转移至含HBSS溶液的无菌培养皿中，再转移至无菌分离操作台，于解剖显微镜下打开子宫，取出胎鼠，剪下胎鼠头，剥离脑膜，分离双侧皮层，无菌手术刀切碎组织（整个操作过程尽量控制在15～20 min完成，以保证较好的细胞活性）。加入6 mL PBS溶液悬浮组织，转移至离心管中，静置5 min，弃去上清液；加入2.5 mL含500 μL胰酶、400 μL DNase I的PBS溶液，混匀，于37 ℃水浴中温育25 min；弃上清，加入5 mL含20% FBS的DMEM/F12培养基，反复吹打，经细胞过滤器（40 μm）滤过，收集滤液；离心，弃上清，加入35% Percoll分离液，将沉淀物转移至离心管中，混合均匀，离心；加入65% Percoll分离液，离心；转移上清液至新的离心管中，加入DMEM/F12培养基，混匀，离心；弃上清，再加入DMEM/F12培养基，吹打至肉眼不可见漂浮物，离心；弃上清液，加入N2 plus DMEM/F12培养基，吹打均匀后，进行细胞计数。

细胞接种于培养瓶中，分别加入EGF、FGF（20 ng/mL），轻轻混匀，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。培养3～4 d，更换培养液；培养6～7 d，收集细胞悬浮液，离心，弃上清液，加入Accutase细胞分离液消化，加入DMEM/F12培养基，吹打至肉眼不可见漂浮物，离心；弃上清液，加入N2 plus DMEM/F12培养基，细胞计数后，按照所需细胞密度接种于培养瓶或培养板中。

2.2 藁本内酯对NS/PCs存活率的影响

NS/PCs以5×104/孔接种于24孔板中，适应30 min。设置对照组和藁本内酯（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μmol/L）组，各给药组加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基，培养24 h，按WST-1试剂说明书检测各组细胞存活率。

2.3 藁本内酯对NS/PCs p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β和active-β-catenin蛋白表达的影响

NS/PCs以1×106/孔接种于6孔板中，设置溶剂组和藁本内酯（25 μmol/L）组，给药组加入药物，溶剂组加入0.006%二甲基亚砜（DMSO），培养24 h。收集细胞，以PBS溶液洗涤，弃去上清液，加入110 μL含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液（含50 mmol/L Tris-HCL、1 mmol/L EDTA、0.1%脱氧胆酸钠、1% TritonX-100），于冰水浴中超声裂解。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，加入上样缓冲液，95 ℃加热5 min使蛋白变性，放置至室温后，于 -80 ℃保存。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1 h，分别加入p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β、active-β-catenin、β-actin抗体，4 ℃孵育过夜；以TBST溶液洗涤，加入HRP标记的二抗（1∶5000），室温孵育1 h；以TBST溶液洗涤，加入ECL发光试剂反应1 min，于成像系统仪中曝光，使用CS Analyzer 4.Version 2.1.2软件进行定量分析。

2.4 藁本内酯对NS/PCs神经球直径的影响

NS/PCs以5×105/孔接种于25 cm2培养瓶中，培养4 d。设置溶剂组和藁本内酯（25 μmol/L）组，给药组加入药物，溶剂组加入0.006% DMSO。分别于给药后第1、2、3天，于显微镜下拍照，随机选取5张照片，使用显微镜自带的软件测量视野下神经球的直径（直径＜40 μm不计入）。

2.5 藁本内酯对NS/PCs分化类型的影响

NS/PCs原代分离培养7 d，消化后加入分化培养基（含2% B27、0.5% FBS、1%双抗的DMEM/F12培养基），调整细胞密度为1×105/mL，以2×104/孔接种于24孔板中（培养板预先用poly-D-lysine溶液包被），设置对照组、溶剂组和藁本内酯（25 μmol/L）组，给药组加入100 μL药物，溶剂组加入等体积0.006% DMSO，对照组加入不含药物的培养基，分化3 d时更换新鲜培养基，分化5 d进行细胞免疫荧光染色。

以PBS溶液洗涤，弃去洗液，加入4%多聚甲醛，室温固定10 min；弃去固定液，以PBS溶液洗涤，加入0.2% TritonX-100，室温透化10 min；弃去上清液，加入封闭液，室温封闭30 min；弃去封闭液，分别加入β3-tublin抗体（1∶500）、vimentin抗体（1∶2000），4 ℃孵育过夜；以PBS溶液洗涤，加入山羊抗兔或鼠IgG抗体（1∶200）孵育1 h；弃去溶液，加入含细胞核染料Hoechst33342（1∶2000）的PBS溶液清洗3次，弃去洗液，封片，于显微镜下观察并拍照。

2.6 藁本内酯对分化细胞存活率的影响

NS/PCs以5×104/孔接种于24孔板中，设置溶剂组和藁本内酯（25 μmol/L）组，按“2.5”项下方法处理细胞，分化3 d时更换新鲜培养基，分化5 d按WST-1试剂说明书检测各组细胞存活率。

2.7 数据分析

数据以±s表示，使用SAS 8.2软件进行单因素方差分析，Tukey’s检验作事后分析。

3 结果

3.1 藁本内酯对NS/PCs存活率的影响

如图1所示，与对照组比较，25 μmol/L藁本内酯可显著增加NS/PCs存活率（P＜0.05）。

图1 藁本内酯对NS/PCs存活率的影响 (±s, n = 5)Fig.1 Effect of ligustilide on survival rate of NS/PCs(±s, n = 5)

3.2 藁本内酯对NS/PCs p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β和active-β-catenin蛋白表达的影响

如图2所示，与溶剂组比较，藁本内酯可显著上调NS/PCs中p-Akt/Akt、active-β-catenin蛋白表达水平（P＜0.05），但对p-GSK3β/GSK3β蛋白表达无明显影响。

图2 藁本内酯对NS/PCs p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β和active-β-catenin蛋白表达的影响 (±s, n = 6)Fig.2 Effect of ligustilide on p-Akt, Akt, p-GSK3β, GSK3β and active-β-catenin protein expressions in NS/PCs (±s, n = 6)

3.3 藁本内酯对NS/PCs神经球直径的影响

如图3所示，随着培养时间的增加，NS/PCs神经球直径逐渐增大；连续给予藁本内酯1～3 d，与溶剂组比较，NS/PCs神经球直径有所增加，但无统计学差异。

图3 藁本内酯对NS/PCs神经球直径的影响 (±s, n = 6)Fig.3 Effect of ligustilide on diameter of neurospheres in NS/PCs (±s, n = 6)

3.4 藁本内酯对NS/PCs分化类型的影响

以β3-tubulin标记神经元，vimentin标记星型胶质细胞，Hoechst33342标记细胞核。如图4所示，藁本内酯对神经元和星形胶质细胞的分化均无显著影响。

图4 藁本内酯对NS/PCs分化类型的影响 (±s, n = 4)Fig.4 Effect of ligustilide on differentiated type of NS/PCs (±s, n = 4)

3.5 藁本内酯对分化细胞存活率的影响

如图5所示，与溶剂组比较，藁本内酯显著提高分化细胞的存活率（P＜0.05）。

图5 藁本内酯对分化细胞存活率的影响 (±s, n = 8)Fig.5 Effect of ligustilide on survival rate of differentiated cells (±s, n = 8)

4 讨论

脑缺血后神经元大量死亡，刺激内源性的神经干细胞开始分化，但由于缺血后内环境的恶化，导致新生的NS/PCs逐渐死亡，影响后期的分化和神经单元的重构。因此，维持脑缺血后早期阶段NS/PCs的持续增殖和存活是后期神经元和神经功能恢复的基础[12]。本研究采用课题组前期建立的NS/PCs分离培养方法[13]，获得生长状态良好、较稳定的神经球，可用于药物的研究。由于NS/PCs自我更新和多功能的特性，孕鼠状态、分离时间、温度、培养基、操作等细节均会影响细胞悬浮状态或生长，因此，严格控制实验条件，对于获得状态较稳定的细胞至关重要。

细胞的增殖和分化是神经干细胞的2个重要特性。本研究首先检测了藁本内酯对NS/PCs增殖的影响，WST-1法为检测细胞数量与活力的方法之一，结果显示，25 μmol/L藁本内酯可促进NS/PCs增殖，且呈非线性关系。查阅文献，部分学者报道，藁本内酯在体内的药动学研究呈非线性[14]，藁本内酯对缺氧缺糖神经细胞PC12具有双向调节作用[15]，提示对藁本内酯进行研究时，应关注剂量对药理作用的影响。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-Akt为神经干细胞增殖、存活、分化、迁移中的重要通路[16-17]，Akt、p-GSK3β、activeβ-catenin为PI3K介导的通路中的关键蛋白[18]，Akt可直接激活β-catenin或通过GSK3β间接激活β-catenin[19]。正常状态下，细胞质中的β-catenin与GSK3β、APC等形成蛋白复合体，磷酸化后最终通过泛素化-蛋白酶系统降解；而非磷酸化的β-catenin则转移至细胞核，与转录因子结合，参与细胞的增殖、分化等[20-21]。本研究结果显示，藁本内酯可通过激活PI3K-Akt/β-catenin通路促进NS/PCs增殖。

神经元和星型胶质细胞是NS/PCs主要的2种分化类型，vimentin为星形胶质细胞早期标志物，β3-tubulin为神经元早期标志物[22]。结果显示，藁本内酯对星形胶质细胞和神经元细胞分化均无显著影响，但分化细胞活力却有所提高；镜下观察，未被vimentin或β3-tubulin标记的细胞有所增加，推测藁本内酯可能促进其他类型细胞的分化（图6）。

图6 藁本内酯对NS/PCs可能的作用机制Fig.6 Proposed mechanisms of ligustilide on NS/PCs

以往对藁本内酯治疗脑缺血损伤的研究主要集中于改善血流或神经保护，对促进神经元修复研究较少。本课题组前期研究发现，川芎提取物对脑缺血后大鼠海马区神经母细胞增殖具有促进作用。因藁本内酯为川芎中含量较大的成分之一，并且体外筛选其表现出较好的神经药理活性，故选择藁本内酯这一研究对象，从促进神经干细胞增殖这一新的角度，阐释了藁本内酯通过激活Akt/β-catenin通路促进NS/PCs增殖，提示藁本内酯为神经修复治疗研究的潜在药物之一。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突