猪流行性腹泻病毒与新发腹泻病毒混合感染分析

焦文强，邢广旭，徐引弟，王 丽，王治方，王克领

(1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002；2.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002；3.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南 郑州 450002)

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)于2012年在香港首次报道[1]，目前亚洲的多个国家均有PDCoV的报道[2-4]，在我国，多个省份也都检测到PDCoV，发病率差异较大[5-7]。其临床表现比猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)相对温和，但是不同区域阳性率差异较大，可能是由于PDCoV不断遗传变异导致不同区域的流行毒株毒力差异。猪肠道α冠状病毒(Porcine enteric alphacoronavirus,PEAV)由2个研究团队于2017年报道，其是一种新型Bat-HKU2样冠状病毒[8-9]，死亡率高达90%[10]。

仔猪腹泻是危害养猪业健康发展的重要疫病，目前引起仔猪腹泻病原种类繁多，多种病原混合感染是诱发仔猪腹泻的重要原因。PEDV是当前主要的仔猪腹泻病原，PDCoV和PEAV是近年来新近报道诱发腹泻的病原体，但是目前尚没有报道证明PDCoV、PEAV和PEDV混合感染的情况。因此，对这3种病原混合感染情况进行分析可以确定目前仔猪腹泻中新发病原与现存主要病原在猪群中的流行情况，为腹泻类疾病防控措施提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 反转录酶M-MLV、DL2 000 DNA marker、PrimeSTAR Max Premix(2×)高保真酶、DNA纯化回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒、pMD20-T simple载体、大肠杆菌JM109感受态细胞均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；RNA提取试剂盒，购自QIAGEN公司。

1.2 病料 鉴定为PEDV阳性的腹泻疑似病料(2014—2018年采集于河南、河北、山东、山西、江西等省份)由河南省农业科学院畜牧兽医研究所保存。

1.3 试验方法

1.3.1 引物设计与合成 检测PDCoV引物根据病毒保守区域设计合成，上游引物：5′-GCTGATGATCTACTCGATT-3′,下游引物：5′-ACTACTTCAAGCTCAGGGAGCTT-3′，目的片段大小约为866 bp。检测PEAV的引物参考PEAVS基因的序列，上游引物：5′-GGCCTCTATTAGAGTGCTTTA-3′,下游引物:5′-GTAGGATATTCAACCTCACTAT-3′，目的片段大小为770 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.2 PDCoV和PEAV的检测 按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA后进行反转录，以反转录合成的cDNA为模板进行PCR反应，PCR反应体系和反应程序参考Prime STAR Max Premix(2×)高保真说明书进行，反应结束后取5 μL样品进行凝胶电泳检测。

1.3.3 PDCoV和PEAVS基因的克隆 对于PDCoV和PEAV阳性的样品，采用参考文献[11-12]的引物进行S基因全长的扩增。PCR扩增结束后回收目的片段，并与pMD20-T simple连接，转化至JM109感受态细胞，挑选阳性克隆进行测序，使用DNASTAR中的 Edit Seq进行序列拼接，采用MEGA 6.0软件构建系统进化树。

2 结果

2.1 PEDV、PDCoV和PEAV共感染的比例 在191份检测为PEDV阳性样品中，PDCoV和PEAV阳性样品分别为12份和1份。PEDV、PDCoV和PEAV共感染的比例为0.52%。PDCoV和PEAV扩增结果如图1所示。

图1 PDCoV和PEAV的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of PDCoV and PEAVM:DL2 000 DNA 相对分子质量标准；1～2:阴性对照；3～4:阳性对照；5～6:PDCoV与PEAV基因片段M:DL2 000 DNA marker;1-2:Negative control;3-4:Positive control;5-6:PDCoV and PEAV gene fragment

2.2 PDCoV和PEAVS基因的克隆 本试验共获得5株PDCoVS基因序列，但未能得到PEAV毒株S基因序列。

2.3 PDCoV 核苷酸与氨基酸同源性分析 将本试验得到的CH-HEBHD-2016(2016年采集自河北邯郸)、CH-HENNY-2017(2017年采集自河南南阳)、CH-HENXY-2016(2016年采集自河南信阳)、CH-HENZK-2017(2017年采集自河南周口)、CH-SHANXCZ-2017(2017年采集自山西长治)这5株PDCoVS基因序列与GenBank中下载的序列进行比对，结果如图2、图3所示，本试验得到的5株序列与GenBank中下载的序列核苷酸同源性为97.2%～99.3%，氨基酸同源性在96.6%～98.9%。

图2 PDCoV S基因核苷酸序列的比对分析Fig.2 Nucleotide homology comparative analysis of S gene of PDCoV

图3 PDCoV S基因氨基酸序列的比对分析Fig.3 Amino acid homology comparative analysis of S gene of PDCoV

2.4 PDCoVS基因遗传进化分析 将本试验得到的5株PDCoV与GenBank中下载的序列构建系统进化树，如图4所示，CH-HENNY-2017、CH-HENXY-2016、CH-SHANXCZ-2017、CH-HEBHD-2017这4株序列与HNZK-06形成一个分支，亲缘关系比较接近；而CH-HENZK-2017与CH-GDD5-2014、CH-SXD2-2015形成一个分支，亲缘关系较为接近。

图4 基于PDCoV S基因的系统进化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of PDCoV based on S gene▲：本试验分离株▲：The strains isolated in this study

3 讨论

腹泻类疾病一直是困扰养猪业健康发展的重要疾病，特别是哺乳仔猪，腹泻不仅会造成断奶仔猪体重下降，影响保育猪增重，并且降低猪只对疾病抵抗力；严重的腹泻会因脱水而死亡。冠状病毒是影响仔猪腹泻的重要病原之一，PDCoV和PEAV是新近报道的2种诱发腹泻的冠状病毒，对临床采集样本进行PDCoV和PEAV感染情况分析对于腹泻疫病的防控具有重要意义；同时，PEDV已经被确定为目前引起仔猪腹泻的最主要的病原，考虑到临床生产中疫病混合感染的复杂性和多样性，开展PEDV、PDCoV和PEAV共感染分析，对于仔猪腹泻的防控具有重要意义。

本试验中，在191份检测为PEDV阳性样品中，PDCoV和PEAV阳性样品分别为12份和1份。PEDV、PDCoV和PEAV共感染的比例为0.52%。共得到5株PDCoV序列，未能得到PEAV毒株S基因序列。结果表明，目前河南省及周边省份PEDV仍然是主要的仔猪腹泻病原，但是PDCoV与PEAV也已经在猪群中传播，未来仔猪腹泻病原可能更加复杂。由于冠状病毒的S蛋白识别并结合细胞表面受体，诱导病毒囊膜和靶细胞膜进行融合，其编码的抗原表位诱导产生中和抗体，因此，S蛋白被广泛用于疫苗研发和遗传进化分析[13]。

根据PDCoV 5株序列的核苷酸和氨基酸比对结果分析，这5株序列与国内分离株核苷酸同源性为97.2%～99.3%，氨基酸同源性为96.6%～98.9%，表明核苷酸编码的氨基酸已经发生变异，这种变异对于病毒的致病性和相关生物活性的影响有待于进一步分析。系统进化树分析表明，CH-HENNY-2017、CH-HENXY-2016、CH-SHANXCZ-2017、CH-HEBHD-2017这4株序列与HNZK-06形成一个分支，亲缘关系比较接近，呈现出明显的低于特征；而CH-HENZK-2017与CH-GDD5-2014、CH-SXD2-2015形成一个分支，亲缘关系较为接近。本试验结果提示，河南范围内流行的PDCoV可能是多种不同亚型，相互之间发生变异或者重组。由于本试验获得的样本数过少，需加大临床中PDCoV的采集工作，获得更多的PDCoV数据才能够进一步分析。