基于网络药理学和分子对接的“当归-川芎”药对作用机制研究

袁可欣，谭 艺，张成玲，韦佳慧，戴雪杉，徐晓玉，陈 怡

西南大学 药学院中医药学院/重庆市高校中药新药筛选重点实验室/药学国家级实验教学示范中心，重庆 400715

当归性温味甘，归肝、 心、 脾经，具有补血调经、 活血止痛的功效； 川芎性温味辛，归肝、 胆、 心包经，具有活血行气、 祛风止痛的功效．“当归-川芎”常形成药对增强其行气活血、 补血养血的作用，如四物汤、 佛手散、 血府逐瘀汤、 补阳还五汤、 温经汤和生化汤等经典名方[1-3]，但“当归-川芎”药对的物质基础及作用机制尚未阐明．网络药理学是融合了系统生物学、 生物信息学的新兴交叉学科，近年来，被广泛应用于中药的研究中，它通过构建“药物-靶点-通路”多层次网络，系统综合地观察中药对整个疾病网络的调控作用，有利于阐明中药多成分、 多靶点、 多途径协同作用的机制[4-5].

本研究通过TCMSP，SEA数据库和文献检索，收集“当归-川芎”药对活性成分及其靶点，构建“成分-靶点”网络，分析得到关键靶点，寻找其与美国食品药品监督管理局(FDA)批准药物靶点的共同靶点，利用TTD和TCMSP数据库分析与共同靶点相关的疾病，建立“共同靶点-疾病”网络．对关键靶点进行基因功能和KEGG通路分析，将活性成分和关键靶点进行分子对接验证.

1 材料与方法

1.1 “当归川芎”药对活性成分的筛选

通过检索TCMSP(http：//lsp.nwu.edu.cn/index.php)，SEA(http：//sea.bkslab.org/)数据库和文献，收集“当归-川芎”药对中当归、 川芎所含成分，然后利用药代动力学参数，即口服生物利用度OB≥30%，类药性DL≥0.18及小肠上皮细胞渗透率Caco-2≥-0.40，筛选出当归、 川芎的活性成分.

1.2 “当归川芎”药对“成分靶点”网络的构建和关键靶点的筛选

通过检索TCMSP，SEA数据库，获得当归、 川芎活性成分的靶点，利用蛋白质数据库UniProt(http：//www.uniprot.org/)的搜索功能，将靶点转换为UniProt ID导入STRING数据库，进行成分-靶点间关联性分析，运用Cytoscape 3.5.0软件构建出“当归-川芎”药对“成分-靶点”网络．使用中间介数、 接近中间度、 度值3个指标，对网络进行分析，选择3个指标均大于平均值的靶点作为网络中的关键靶点.

1.3 共同靶点的筛选以及相关疾病分析

利用Drug Bank (https：//www.drugbank.ca/)和TTD(https：//db.idrblab.org/ttd/)数据库，收集FDA批准药物靶点，筛选得到关键靶点和药物靶点的共同靶点．利用TCMSP和TTD数据库获得共同靶点相关疾病，按照医学主题词表MeSH(http：//www.nlm.nih.gov/mesh/)将疾病分类，运用Cytoscape 3.5.0软件构建出“共同靶点-疾病”网络.

1.4 关键靶点的富集分析和分子对接

将关键靶点导入DAVID数据库(https：//david.ncifcrf.gov/)，进行基因功能和KEGG通路富集分析．从Pubchem数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取“当归-川芎”药对活性成分的分子结构，将其与关键靶点导入Systems Dock Web Site(http：//systemsdock.unit.ois.jp/iddp/home/index)数据库进行分子对接．对接分数为实验解离/抑制常数值(pKd/pKi)的负对数，大于4.25，表明分子与靶点具有一定的结合活性； 大于5.0，表明分子与靶点结合活性较好； 大于7.0，表明分子与靶点具有强烈的稳定性及活性.

2 结 果

2.1 “当归川芎”药对的活性成分

通过检索TCMSP，SEA数据库，获得当归成分125个，川芎成分189个，阈值设定为OB≥30%，DL≥0.18以及Caco-2≥-0.40，共筛选出候选活性成分8个，其中当归2个，川芎6个．通过查阅文献获得10个活性成分，其中当归4个，川芎6个．去除重复成分，最终得到14个活性成分，其中川芎和当归共有活性成分4个，分别是咖啡酸、 阿魏酸、 洋川芎内酯I、 藁本内酯(表1).

表1 “川芎当归”药对的活性成分

2.2 “当归-川芎”药对的“成分-靶点”网络

利用TCMSP，SEA数据库，发现川芎12个活性成分对应127个靶点，当归6个活性成分对应337个靶点，删除重复的靶点，“当归-川芎”药对14个活性成分对应257个靶点．“当归-川芎”药对的“成分-靶点”网络包含257个节点和2 388条边(图1)．分析网络节点的中间介数、 接近中间度及度值的平均值，分别为0.003 5，0.441 1，16.925 3，筛选3个指标均大于等于平均值的靶点，得到54个关键靶点，其中11个是当归和川芎共有靶点，分别是PTGS1，VDR，PTGS2，CDC25A，CYP19A1，NR1H4，PRKACA，AR，ESR2，ADRB2，NCOA2，这些靶点可能是川芎和当归协同作用的物质基础.

两边的六边形分别表示川芎和当归的有效成分，其中浅紫色的表示当归和川芎的共有成分，中间的橙色圆形表示“当归-川芎”药对的靶点，紫色圆形表示关键靶点，黄色圆形表示关键靶点中的共有靶点．图1 “当归川芎”药对“成分靶点”网络

2.3 “共同靶点疾病”网络的构建与分析

通过TTD和Drug Bank数据库，获得1 215个FDA批准药物靶点，54个关键靶点和FDA批准药物靶点有34个共同靶点．通过TTD和TCMSP数据库分析，构建的“共同靶点-疾病”网络由168个点和264条边组成，共同靶点与21组共113种疾病相关，包括肿瘤(14.2%)、 神经系统疾病(12.4%)、 心血管疾病(8.8%)、 心理疾病(8.8%)、 病理状况(7.1%)和女性生殖系统疾病(5.9%)等(图2)，这可能是“当归-川芎”药对潜在的治疗靶点和对应的疾病.

红色椭圆代表关键靶点和FDA批准药物靶点的共同靶点，紫色菱形代表疾病，黄色长方形代表疾病所属大类，根据MeSH分为21组．图2 关键靶点-疾病网络

2.4 基因功能及KEGG通路富集分析

34个共同靶点提示的是“当归-川芎”药对潜在作用的疾病，而54个关键靶点能更全面地反映“当归-川芎”药对的成分靶点，因此将54个关键靶点导入DAVID数据库，从生物学过程、 分子功能和细胞组分3个不同的方面对基因功能进行分析．结果显示，54个关键靶点共涉及155个生物过程、 29个细胞组分和66个分子功能，其中生物过程中排名前5的有Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter(19个靶点/35.2%)，Transcription DNA-templated(14个靶点/25.9%)，Signal transduction(13个靶点/24.1%)，Negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter(12个靶点/22.2%)，Response to drug(11个靶点/20.4%)．细胞组分中排名前5的有Nucleus(34个靶点/63%)，Plasma membrane(27个靶点/50.0%)，Nucleoplasm(24个靶点/44.4%)，Cytosol(23个靶点/42.6%)，Cytoplasm(23个靶点/42.6%)．分子功能中排名前5的有Protein binding(46个靶点/85.2%)，Enzyme binding(19个靶点/35.2%)，Transcription factor activity，Sequence-specific DNA binding(13个靶点/24.1%)，DNA binding(13个靶点/24.1%)，Protein homodimerization activity(12个靶点/22.2%)(图3)．这表明“当归-川芎”药对可能参与了人体内的多种生物过程.

图3 排名前5的基因功能分析

KEGG通路富集分析结果显示，54个关键靶点共参与58条信号通路过程，其中包括Pathways in cancer，Estrogen signaling pathway，Proteoglycans in cancer，Calcium signaling pathway，HIF-1 signaling pathway等，涉及癌症、 黏附、 细胞周期、 炎症、 细胞凋亡、 血管生成及激素调节等，表2展示了涉及靶点数目排名前20的通路信息.

表2 排名前20的KEGG通路信息

2.5 “当归川芎”药对活性成分与关键靶点有结合活性

将“当归-川芎”药对活性成分豆甾醇、 β-谷甾醇、 洋川芎内酯A、 藁本内酯、 阿魏酸和4-羟基-3-丁基苯酞与度值排名前10的关键靶点进行分子对接．结果表明，6个活性成分与7个靶点对接成功，其中豆甾醇、 β-谷甾醇、 洋川芎内酯A、 藁本内酯与NCOA2，ESR2，EP300，ESR1等靶点有较好的结合活性以及稳定性(表3).

表3 “当归川芎”药对活性成分与关键靶点分子对接

3 讨 论

当归、 川芎都是血分之主药，当归味甘，具有养血活血之功效，川芎味辛，是血中气药，具有活血祛瘀、 行血散血的功效，两者相使配伍同用，可增强活血化瘀、 养血活血之功效，因此“当归-川芎”常作为活血化瘀的药对使用，但它们配伍增效的物质基础并未阐明，我们通过数据库和文献检索获得川芎和当归14个有效成分，其中4个共有成分，分别是咖啡酸、 阿魏酸、 洋川芎内酯I、 藁本内酯．其中咖啡酸和阿魏酸是酚酸类成分，咖啡酸在机体内儿茶酚氧位甲基转移酶的作用下可转化成阿魏酸，而阿魏酸具有抗氧化、 抗血栓、 降血脂、 降低心肌缺氧、 抗菌、 抗肿瘤和脑保护等多种药理作用[6-7]．洋川芎内酯I和藁本内酯是苯酞类成分，洋川芎内酯I具有保护脑、 抗凝血作用，藁本内酯具有抗动脉粥样硬化、 抗炎镇痛、 抗老年痴呆、 抗脑缺血、 抗肿瘤、 抗脂质过氧化、 改善微循环等作用[8-9]．这些共有成分可能是“当归-川芎”药对配伍增效的物质基础，可以进一步通过成分敲出、 敲入等技术来验证.

“当归-川芎”常常配对使用，尤其多见于一些治疗妇科疾病的名方，比如四物汤、 佛手散、 血府逐瘀汤、 温经汤等．通过数据库检索发现，构建和分析“当归-川芎”药对的“成分-靶点”网络，获得54个关键靶点，其中11个是川芎和当归共有靶点，分别是PTGS1，VDR，PTGS2，CDC25A，CYP19A1，NR1H4，PRKACA，AR，ESR2，ADRB2，NCOA2．有研究发现PTGS2是FDA批准的治疗子宫内膜异位症的靶点之一[10]，而且“当归-川芎”药对中的阿魏酸和川芎嗪能抑制PTGS2的表达[11-14]．CYP19A1参与雌激素合成，ESR2是雌激素受体，分子对接结果中，豆甾醇、 β-谷甾醇、 洋川芎内酯A、 藁本内酯与ESR2有较好的结合活性，也有研究发现阿魏酸和川芎嗪能抑制雌激素水平[4，10]，但是“当归-川芎”药对及其活性成分对CYP19A1和ESR2的作用还未见报道，值得研究．其中34个关键靶点也是FDA批准药物靶点，PTGS2，ESR2可作为治疗女性生殖系统疾病及妊娠并发症的靶点，进一步KEGG通路富集分析发现，关键靶点调控多条与雌激素、 孕激素相关的通路，包括Estrogen signaling pathway，Oxytocin signaling pathway，Progesterone-mediated oocyte maturation，GnRH signaling pathway，Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption，这可能是“当归-川芎”配对用于治疗妇科疾病的机制，值得进一步深入研究.