雄性犏牛不育机制的研究进展

闵星宇，熊显荣,*，熊 燕，张 贺，郝振宇，李 键,*

（1.西南民族大学畜牧兽医学院，四川成都 610041；2.青藏高原动物遗传育种资源保护与利用国家教育部重点实验室，四川成都 610041）

犏牛是分布于我国青藏高原地区的重要家畜之一，为牦牛与普通牛的杂交后代，主要做肉用、乳用和役用，在藏区占有极其重要的经济地位。犏牛体格大生长快，在产奶量和产肉量方面均较牦牛具有显著的优势[1-2]。相对于牦牛肉和黄牛肉，犏牛肉具有高蛋白、低脂肪等特点，其氨基酸组成、不饱和脂肪酸以及风味物质含量更为丰富[3]。牦牛产奶量低，奶牛又不适应青藏高原高寒低氧的气候，牦牛和奶牛杂交的犏牛不仅产奶量高，还能耐受高原高寒低氧的恶劣环境[4]，且具有较高的乳品质，犏牛乳制作的酥油中含有更丰富的亚油酸、亚麻油酸等多不饱和脂肪酸[5-6]。尽管犏牛在生产性能、乳肉品质和高原适应性上具有明显的优势，但其杂种雄性不育的缺陷无法通过横交固定优良性状，严重阻碍了杂种优势的利用。随着生命科学的快速发展，国内外对雄性犏牛不育机制的研究愈来愈深入，但精子发生是一个极其复杂的过程，至今还没有解决犏牛不育这一重大科学难题。杂种不育的现象还广泛存在于近缘物种杂交中，国内外学者对其杂交后代不育的机制都进行了研究，如马和驴的杂交后代[7]、不同种类狐狸的杂交后代[8]、鸡和鹌鹑的杂交后代[9]、家鸭和番鸭的杂交后代[10]。造成雄性犏牛不育的原因有很多，本文主要综述雄性犏牛生殖系统形态结构差异、犏牛雄性不育的生理机制和分子机制的研究进展。

1 犏牛雄性不育的形态结构变化

造成雄性不育的因素有很多，其中最直接且最容易观察到的是生殖系统形态结构的变化。犏牛和牦牛的睾丸形态、颜色高度相似，无显著差异，但犏牛的睾丸重量大小显著低于牦牛，并且牦牛睾丸白膜上血管多而密集，犏牛睾丸白膜血管稀少、实质发育不丰满、质地松软[11]。生精小管为睾丸小叶内细长弯曲的小管，主要由生精细胞和支持细胞组成，是雄性生殖细胞增殖分化和精子发生的场所，生精小管异常会直接影响雄性的生殖力。通过比较犏牛与亲本牦牛和黄牛睾丸组织发现（图1），犏牛生精小管及其上皮发育不良，生精小管高度空泡，粗细不均，有的管壁呈皱缩状，其基底膜缩小，呈纤维化状态[12-14]。间质细胞具有重要的激素分泌功能，与牦牛睾丸的间质组织相比，犏牛间质组织成分少，睾丸间质细胞与小管之间有明显的空隙，间质细胞数量较少、体积小、分布松散、多处于休止状态并呈巢状集聚，激素水平低[12]。与犏牛生殖细胞组成相比，雄性牦牛睾丸中丰富的生精细胞分布于从基膜到生精小管腔的各处，管腔内出现圆形的精细胞或延长的精子；而犏牛睾丸中生精小管只含有支持细胞和少数精原细胞，几乎没有可识别的生殖细胞或精母细胞，单层生精细胞松散地附着在基底膜上并表现出变性的形态，精原细胞凋亡增多，细胞减数分裂进程受阻于粗线期中期[1,13,15-16]。Shah 等[17]使用STA-PUT 法分离得到犏牛睾丸中的精原细胞和精母细胞，发现犏牛精原细胞和精母细胞直径显著小于牦牛和黄牛。Sato 等[18]研究发现，在F1和F2代杂种牛睾丸中精子发生完全停滞，而在部分F3代杂交牛睾丸中显示精子发生，表明不但F1、F2、F3代杂种公牛可育性具有渐进性，同一世代的不同个体间也表现出差异。综上所述，犏牛与亲本牦牛和黄牛在雄性生殖器官形态大小与发育状况、睾丸组织的显微结构与细胞组成上存在差异，这些形态结构上的变化可能是造成雄性犏牛不育的直接原因，而在生殖系统形态结构上分析使犏牛不育的原因可能是犏牛睾丸中与调控细胞周期、细胞增殖和凋亡基因的差异表达。

2 雄性犏牛不育的生理机制

垂体是家畜重要的内分泌腺器官，与下丘脑和性腺构成下丘脑—垂体—性腺轴，垂体嗜碱性细胞受到下丘脑分泌的促性腺激素释放激素（GnRH）作用而分泌促黄体素（LH）、促卵泡素（FSH）等促性腺激素。犏牛垂体前叶嗜碱性细胞几乎不见，促卵泡素细胞细胞核较严重分叶，胞浆入核，分泌颗粒少而小，引起分泌FSH不足，从而影响生精小管的发育；而促黄体素细胞与牦牛差异不显著，促黄体素细胞分泌的LH 使得睾丸间质细胞发育良好，这也解释了雄性犏牛表现出正常的雄性特征和性行为[19-20]。雄激素和雄激素受体（Androgen Receptor，AR）信号是精子发生所必须的，在产生睾酮和二氢睾酮（DHT）的过程中3β-羟基类固醇脱氢酶（3-β-HSD）和5-α-还原酶2（SRD5A2）等发挥重要作 用。Sato 等[18]检 测AR、3-β-HSD 和SRD5A2 在 间质细胞中的表达情况，发现雄性犏牛AR 和3-β-HSD 的表达水平与牦牛相比差异显著，提示犏牛睾丸间质细胞AR 表达降低和3-β-HSD 表达增强可能是导致雄性犏牛不育的原因之一。完整的生理生化过程和正常稳定的内环境才能保证动物生殖功能的正常。综上所述，雄性犏牛下丘脑—垂体—性腺轴生理生化过程的变化是造成不育的又一原因。

3 雄性犏牛不育的分子机制

随着近年来分子生物学的快速发展，从基因组、转录组、蛋白组和表观遗传修饰等多个方面对雄性犏牛不育机制展开研究，从分子层面解释雄性犏牛不育的机制，极大地推动了雄性犏牛不育机制的研究。

3.1 雄性犏牛不育相关基因表达调控的研究 雄性犏牛不育候选基因的功能及表达水平变化如表1 所示。哺乳动物Y 染色体雄性特异性区域（MSY）的基因拷贝数变异和表达失调会影响雄性生殖力。Zhang 等[21-22]对比牦牛、犏牛和F2代杂种牛睾丸特异性蛋白Y（TSPY）、热休克转录因子Y（HSFY）、锌指蛋白280BY（ZNF280BY）、黑色素瘤优先表达抗原Y（PRAMEY）的基因拷贝数和多个MSY 基因的表达水平发现，雄性犏牛和F2代杂种公牛TSPY、HSFY、ZNF280BY和PRAMEY的基因拷贝数显著大于牦牛，犏牛TSPY、ZNF280BY、HSFY、PRM1和PRM2在睾丸中的表达水平显著低于牦牛和黄牛。Zhang 等[22]检测黄牛、牦牛和犏牛睾丸中Y 染色体X 简并区10 个基因的表达水平，发现Y 染色体上普遍转录的四肽重复序列（UTY）、Y 染色体连锁的口面指综合征1 基因（OFD1Y）和Y染色体连锁的泛素特异肽酶基因（USP9Y）的高表达可能与雄性犏牛不育有关。Das 等[23]根据Y 染色体在哺乳动物基因组中的序列信息和位置对牦牛12 个MSY基因进行了鉴定和分析，结果显示牦牛和黄牛MSY 之间的序列不匹配可能导致雄性犏牛减数分裂重组失败。

表1 雄性犏牛不育候选基因的功能及表达水平变化

无精子症缺失基因（DAZ）家族是在生殖细胞中特异性表达的参与控制减速分裂的基因，非灵长类哺乳动物DAZ 家族包括DAZL和BOULE。Zhang 等[16,24]实验表明，b-DAZL和b-BOULE在睾丸中特异性表达，犏牛睾丸中的表达水平显著低于牦牛睾丸，证明b-DAZL和b-BOULE 可能是牦牛正常生育时配子发生的关键调节因子。Liu 等[25]检测犏牛DAZL的mRNA 的表达水平并得到了一致的结果。Li 等[26]鉴定到牦牛BOULE的两种选择性剪接变异体，分别命名为b-BOULE1和b-BOULE2，发现b-BOULE和b-BOULE1的mRNA 转录水平在牦牛睾丸中显著高于犏牛，b-BOULE2差异不显著。DAZ 家族基因在犏牛睾丸中的差异表达和b-BOULE基因部分选择性剪接变异可能是犏牛不育的原因之一。

Huang 等[27]研究发现，犏牛睾丸中有8 个乳酸脱氢酶C（LDHC）剪接变异体，LDHC的mRNA 表达水平显著降低，表明选择性剪接可能对睾丸中LDHC 的表达起到一定的调节作用，这可能是雄性犏牛不育的原因之一。PIWI 样蛋白1 基因（PIWIL1）的缺失可能导致反转录转座子的过度表达，精子发生停滞造成雄性不育。Gu 等[28]检测PIWIL1和长散布元件-1（LINE-1）反转录转座子mRNA 在黄牛、牦牛和犏牛睾丸中的表达，发现犏牛PIWIL1的低表达影响了转座子沉默机制，导致雄性犏牛不育。Liu 等[29]研究发现，热休克蛋白27（Hsp27）/蛋白53（P53）在不同发育阶段的牦牛和犏牛睾丸中表达不同，认为雄性犏牛Hsp27 的低表达和P53 的高表达可能调控牦牛和犏牛睾丸发育和精子凋亡。此 外，IGF2[30]、SYCP3[31]、Vasa[32]、Dmrt7[13]和Prdm9[15]等基因在犏牛睾丸中的低表达也可能是雄性犏牛不育的原因。

3.2 转录组学在雄性犏牛不育机制上的研究 随着二代高通量测序技术的发展，以RNA-seq 为代表的转录组学技术在雄性犏牛不育发生机制中的研究也越来越多，研究人员分别从信使RNA（mRNA）、小RNA（miRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）等方面展开对雄性犏牛不育机制的研究，并筛选得到可能与雄性犏牛不育的候选基因和非编码RNA（表2）。

表2 转录组学在雄性犏牛不育上的研究

曾贤彬等[33]首次采用高通量测序技术对犏牛和牦牛睾丸组织转录组测序和比较分析，得到了9 089 个在犏牛睾丸中显著差异表达基因（5 000 个上调，4 089 个下调），推测Syce3、Fkbp6、Dmrt7、Spo11、Dmc1、survivin、Bcl-2、Crem等基因的下调和促凋亡相关基因的显著上调导致了雄性犏牛不育。Cai 等[12]利用RNA-seq 分析鉴定了犏牛与牦牛睾丸组织中2 960 个差异表达基因（679 个上调，2 260 个下调），发现STRA8、NLRP14上调与犏牛睾丸组织中未分化精原细胞的积累和细胞的严重凋亡有关，而下调的SPP1、SPIN2B和PIWIL1基因与细胞周期进程和精原细胞基因组的完整性有关，此外许多参与减数分裂的基因也下调。随后的研究中得到了犏牛和牦牛睾丸组织更高分辨率的转录图谱，筛选得到6 477 个差异表达基因（2 919 个上调，3 558 个下调），发现未分化精原细胞的标记基因和凋亡调控基因在犏牛中上调，而分化维持基因下调，在精原细胞有丝分裂中大多数与有丝分裂检查点和细胞周期相关的差异表达基因下调，此外几乎所有与联会复合体组装和减速分裂相关的差异表达基因在犏牛中没有表达[11]。Zhao 等[34]对犏牛和牦牛附睾进行转录组测序分析，发现犏牛和牦牛附睾转录图谱显著差异，鉴定到3 008 个差异表达基因（1 645 个上调，1 363 个下调），许多差异表达基因与精子成熟、运动、宿主防御以及附睾管腔中离子的调节密切相关。

小RNA 是一类非编码单链RNA，包括microRNA（miRNA），小内干扰RNA（endo-siRNA）和Piwi相互作用RNA（piRNA），能够参与调控动物精子发生[35]。Xu 等[36]利用RNA-seq 技术筛选出61 个差异表达miRNAs，推 测bta-miR-135a、bta-miR-378 和btamiR-184 的下调可能导致犏牛精原干细胞数量减少，bta-miR-34b/c 和bta-miR-449 的下调可能导致犏牛有丝分裂到减数分裂的过度失败。在随后的研究中，Xu 等[1]采用STA-PUT 速度沉淀法从黄牛、牦牛和犏牛睾丸中分离得到精原细胞和精母细胞并进行转录组测序，鉴定出27 个差异表达miRNAs，推测bta-let-7 家族、btamiR-125 和bta-miR-23a 的下调削弱视黄醛诱导精原细胞的分化，精原细胞转染分析发现bta-miR-449a 在犏牛中的下调阻碍雄性生殖细胞从有丝分裂向减数分裂的转变。Wang 等[37]使用RNA-seq 技术得到牦牛、犏牛和黄牛睾丸中miRNAs 和piRNAs 的转录图谱并进行联合分析，在黄牛与犏牛组、黄牛与牦牛组和牦牛与犏牛组中，共筛选得到119、14、6 个差异表达miRNAs 以及893、1 065、1 158 个piRNAs。Zhang 等[38]利 用RNA-seq 技术检测牦牛、犏牛和黄牛piRNA 产生的差异，发现在犏牛睾丸中前粗线期源于长散布重复序列的piRNAs 增加，前粗线期源于短散布重复序列的piRNAs 减少，推测粗线期piRNAs 生产中断是导致雄性犏牛精子发生阻滞的原因之一。

LncRNA 是长度大于200 nt 的非编码RNA，在动物精子发生中发挥重要作用[39]。阿果约达等[40]采用RNAseq 技术对3～4 岁成年犏牛和牦牛睾丸组织进行转录组测序，筛选出6 178 个差异表达lncRNAs（2 470 个上调，3 708 个下调）；筛选得到差异lncRNAs 的候选靶基因2 676 个，其中靶基因PTGDS、IGF2、MEST、GLIS3、NOTCH2、HOXA10、HOXA11与雄性犏牛不育相关。有研究人员用1 岁龄犏牛和牦牛睾丸组织进行转录组测序分析，筛选得到604 个差异表达的lncRNAs（469 个下调，135 个上调），生物信息学分析发现这些差异lncRNAs 的靶基因参与犏牛生精细胞的生长、增殖和分化过程等重要的生物学过程，表明这些差异lncRNAs 的异常表达可能导致雄性犏牛生精阻滞[20]。

3.3 蛋白质组学在雄性犏牛不育机制上的研究 随着蛋白质组学技术的发展，同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术由于其独特的优势而被广泛用于定量蛋白质组学研究[41]。Sun 等[42]使用iTRAQ 技术测定犏牛10、12 和14 月龄睾丸组织中蛋白质的差异，发现10 月龄与12 月龄有318 个差异表达蛋白，10 月龄与14 月龄有327 个差异表达蛋白，而12 月龄与14 月龄蛋白表达差异不显著，提示犏牛生精阻滞可能发生于12 月龄左右。Yu 等[14]使用iTRAQ 技术比较分析犏牛和牦牛睾丸组织中的蛋白质，筛选出256 个差异表达蛋白，鉴定出10 种可能与犏牛生精抑制有关的蛋白，发现大量的蛋白可能通过增强细胞黏附力来阻止生殖细胞的迁移同时造成精子发生过程中的代谢紊乱，推测犏牛睾丸中生殖细胞的代谢紊乱及其有害微环境是精子发生阻滞的原因。Yang 等[43]使用高效液相色谱-电喷雾串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）从犏牛和牦牛睾丸蛋白质组中也鉴定到465 个差异表达蛋白。

3.4 表观遗传学在雄性犏牛不育机制上的研究 表观遗传学是指DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑和非编码RNA 调控等非遗传物质改变所致的基因表达水平变化。大量研究发现，大量与精子发生相关的基因在犏牛睾丸中的低表达与其基因启动子或基因本体的高甲基化有关，如DAZL[21,44]、PIWIL1[28]、SYCP3[31]、Vasa[32]、boule[45]、Mei1[46]、FKBP6[47]等。Li 等[48]报道了印迹基因H19 在犏牛睾丸中的表达量显著高于牦牛和黄牛，同时检测到犏牛H19 基因印迹控制区（ICR）的第3 个CCCTC 结合因子（CYCF）位点明显甲基化，推测H19 ICR 中CTCF 结合位点的印迹失调与雄性犏牛生精障碍有关。Zhang 等[38]的实验结果表明，犏牛睾丸PIWI/piRNA 途径中PIWIL1、DDX4、PLD6、MAEL、FKBP6、TDRD1和TDRD5基因启动子高甲基化影响粗线期piRNA 产生，导致犏牛精子发育阻滞。Shen等[49]比较了牦牛与犏牛睾丸中2 种赖氨酸脱甲基化酶（KDM1A、KDM4B）的表达情况并检测了H3K36me3和H3K27me3 的组蛋白甲基化修饰情况，发现犏牛睾丸中KDM1A和KDM4B的mRNA 和蛋白质水平的表达以及H3K36me3 水平显著下降。检测犏牛和牦牛睾丸中组蛋白甲基转移酶的表达和组蛋白甲基化分布，结果表明组蛋白甲基化在犏牛生精失败中具有潜在的作用[50]。Yin 等[51]报道了组蛋白去乙酰化酶1 基因（SIRT1）在犏牛和牦牛睾丸中的生物学作用，认为犏牛睾丸组织中SIRT1 缺乏导致SIRT1 的辅助因子类固醇生成因子1（SF-1）失活和睾丸发育受损。

综上所述，通过目前对雄性犏牛不育分子机制的研究，得到大量差异表达的候选基因和非编码RNA，其功能主要与调控细胞分裂、生殖细胞分化、细胞增殖和凋亡相关。雄性犏牛生精小管中的生精细胞能够分化至精母细胞，但过去的研究主要是笼统地以整个睾丸组织作为研究样本，以犏牛精原细胞和精母细胞作为研究对象进一步筛选验证与精子发生相关的差异表达候选基因可能更好解释雄性犏牛精子发生阻滞的分子机制。

4 结 语

目前对雄性犏牛不育机制的研究成果颇丰，研究人员从组织水平、生理水平、基因组、转录组、蛋白组和表观遗传学等多个方面都取得了进展，筛选鉴定了一批在犏牛睾丸中差异表达的基因、lncRNA、小RNA 和蛋白质，但很少从细胞和动物水平验证其在犏牛雄性不育中的作用机制。新一代测序技术的快速发展和测序价格的降低有助于更加准确、更加全面地鉴定出与雄性犏牛不育相关的候选基因。在未来的研究中，可以建立犏牛雄性生殖干细胞系，使用干扰和过表达技术，从细胞水平验证候选基因、lncRNA 和小RNA 在雄性犏牛不育中的作用机制，然后进一步通过动物实验来验证雄性犏牛不育的候选基因、lncRNA 和小RNA。随着对雄性犏牛不育研究的不断深入，对雄性犏牛不育机制的认识将会更加准确全面，并找到解决雄性犏牛不育问题的方法。