基于水通道蛋白3和核转录因子-κB信号通路探讨电针神阙穴对功能性便秘胃肠动力的改善机制

谢林林，赵玉粒，黄明桂，古远云

(1.西南医科大学附属中医医院经典中医诊疗中心，四川 泸州 646000；2.西南医科大学附属中医医院老年病科，四川 泸州 646000)

功能性便秘是一种与一些胃肠道表现相关的慢性疾病，影响5%～30%的人口，女性和老年人的发病率较高，严重影响患者的生活质量。目前治疗便秘的方法主要包括多糖、膳食纤维、泻药、生物反馈疗法和外科治疗等，但这些治疗策略的疗效有限，且很少有关于这些疗法的长期临床研究。电针疗法是中医常用的一种外治法，通过在传统针刺的基础上增加外部电刺激，可使刺激倍增，治疗效果也相应提高。目前，电针已被各科医生广泛应用于治疗各类疾病，取得了满意的疗效。神阙穴位于脐中，与肠腑相隔，刺激该穴位可健运脾胃。然而，电针神阙穴通便作用的分子机制尚未阐明。水通道蛋白(aquaporin，AQP)是水和水/甘油通道，负责水通过膜的快速运输，目前已鉴定出13种AQP(AQP0—AQP12)。其中，AQP3是结肠中最重要的AQP，与慢性便秘密切相关，有研究表明，AQP3介导了泻药的通便作用。核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)在免疫反应和炎症反应过程中起重要作用。报道显示，AQP3通过NF-κB途径调节肠易激综合征大鼠的液态水代谢异常和肠通透性改变。因此，本研究旨在探讨电针神阙穴对功能性便秘模型大鼠AQP3蛋白和NF-κB信号的影响，并初步探讨其改善功能性便秘胃肠动力的机制。

1 材料

1.1 实验动物 健康SD大鼠40只，体质量(230±20)g，购自四川大学华西医院，使用许可证号为SYXK(川)2018-119，生产许可证号为SCXK(川)2018-026。大鼠饲养于恒温(23±2)℃、相对湿度55%±5%的环境中，常规24 h昼夜循环，并按照实验动物使用的“3R”原则给予人道关怀，实验过程严格遵守实验动物管理条例。

1.2 主要试剂及仪器 盐酸洛哌丁胺(批号 140709510)：西安杨森制药；苁蓉通便口服液(批号 Z10910032)：甘肃天水岐黄药业；苏木素染液(批号 C200301)、伊红染液(批号 C200403)：珠海贝索生物；胃动素(motilin，MTL；批号 ZC-37312)、胃泌素(gastrin，GAS；ZC-37314)、P物质(substance P，SP；批号 ZC-36170)、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2；批号 ZC-36713)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β；ZC-M6681)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6；ZC-36404)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α；ZC-37624)ELISA 试剂盒：上海茁彩生物；一抗AQP3(批号 AF5222)、囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)(批号 DF10310)、蛋白激酶A(protein kinase A，PKA；批号 AF7746)、磷酸化核转录因子-κB p65(phosphorylated nuclear transcription factor-κB p65，p-NF-κB p65；批号 AF2006)、核因子κB抑制蛋白α(inhibitor of nuclear factor-kappa B，IκBα)(批号 AF5002)、ECL发光试剂盒(批号 KF001)：Affinity；生物素化山羊抗兔IgG(重链+轻链；批号 ab6721)：英国abcam；RNA Trizol试剂(vs18061730)：合肥博美生物；TB GreenPremix Ex TaqⅡ(批号 RR820A)：宝日医生物；BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号 P0009)：Beyotime；PIKO Red 96实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪、MK3全功能酶标仪：美国Thermo Fisher。

2 方法

2.1 功能性便秘大鼠模型构建及分组 将大鼠随机分为空白组(

n

=10)，模型组(

n

=30)。大鼠模型复制步骤如下：每只大鼠每日仅给予日平均饮水量的1/3，并灌胃盐酸洛哌丁胺1.5 mg/kg，颈背部皮下注射D-半乳糖125 mg/kg，不限制进食。空白组大鼠给予等量超纯水灌胃，颈背部皮下注射等量生理盐水，不限水，不限制进食。大鼠出现精神状态差，活动量减少，大便粒型小、干硬等表现为模型复制成功。将模型复制成功的大鼠随机分为模型组、苁蓉通便口服液组、电针治疗组，每组10只。

2.2 干预方法 电针治疗组每日9：00将大鼠仰卧固定，电针大鼠神阙穴(胸腹正中线上，剑突至耻骨联合上缘上2/3与下1/3交界处)，进针5 mm左右，每日1次，每次30 min，5次为1个疗程，疗程中间休息2 d，共治疗2个疗程。穴位定位则参照《大鼠穴位图谱的研制》以及李忠仁主编的《实验针灸学》，电针参数参考曹洋等研究结果：强度2 mA，疏密波(疏波4 Hz，密波50 Hz)，以大鼠下肢稍震动为宜。为了避免强制固定时所导致的应激反应误差，空白组和模型组大鼠每日只固定不做任何处理，苁蓉通便口服液组大鼠每日固定并以0.3 mL苁蓉通便口服液灌胃，连续14 d。

2.3 炭末推进实验及粪便含水量测定 治疗结束后，每组取5只大鼠灌胃墨汁，40 min后将大鼠脱颈椎处死，分离肠系膜。从幽门至炭末前沿的距离作为炭末在小肠中推进距离。碳末推进率=碳末在小肠中的推进距离/小肠总长度×100%。收集各组大鼠24 h粪便，称量各组大鼠粪便的湿质量及干质量[先称量粪便湿质量(

m

)，然后将粪便放入烘干箱烘干后再次称量粪便干质量(

m

)]，粪便含水量=(

m

-

m

)/

m

×100%。

2.4 结肠组织病理学观察 收集各组剩余5只大鼠的结肠组织，用4%多聚甲醛固定，将固定组织经脱水、包埋、切片(厚度5 μm)，用苏木精-伊红染色，二甲苯透明，中性树胶封固、光学显微镜下观察。

2.5 MTL、GAS、SP、COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α含量检测 按照ELISA试剂盒说明书操作，检测大鼠结肠组织MTL、GAS、SP、COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

2.6 AQP3、NF-κB p65 mRNA表达水平检测 按照TRIzol试剂盒说明书从结肠组织中提取总RNA，逆转录合成cDNA，用Takara TB GreenPreMix Ex Taq测定基因表达水平。引物序列：

AQP3：5′-GGTTCCATCGCTGGTGTCTTCG TGTA-3′(正向)，5′-CCGAGAGAGGCATCACAAAGGGCTTT-3′(反向)；

NF-κB p65：5′-GCCAGCACCAAGACCGAAG CAATT-3′(正向)，5′-TACCGCCAGCAGCATCTTCACATCTC-3′(反向)；

GADPH：5′-ATCCCATCACCATCTTCCCA G-3′(正向)，5′-CCATCACGCCAGTTTTCC-3′(反向)。

以GAPDH内参。qRT-PCR反应条件：95 ℃初始变性10 min，随后95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，45个循环，记录

C

值，采用2-ΔΔ法分析相对表达水平。

2.7 AQP3、CFTR、PKA、p-NF-κB p65、IκBα蛋白表达水平检测 取大鼠结肠组织，加入蛋白裂解液提取蛋白，冰上孵育离心后，收集上清液，用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。后将上清液与SDS-PAGE样品加载缓冲液混合，并转移到PVDF膜上，在5%脱脂牛奶中室温封闭2 h后，将膜与抗AQP3、CFTR、PKA、p-NF-κB p65、IκBα(均1∶500)或β-actin(1∶2 500)的一抗在4 ℃孵育过夜，随后与二级抗体(1∶3 000)室温孵育1 h，使用化学发光检测试剂盒暗室显色，显色后的蛋白使用Bio-Rad全功能成像系统采集图像，Image-Pro Plus分析光密度，以β-actin为内参，对照组目标蛋白质相对含量为1，计算各组蛋白质的相对表达量，实验重复3次。

3 结果

3.1 电针神阙穴对功能性便秘大鼠粪便粒数、粪便含水量及炭末推进率的影响 大鼠在整个实验过程中均未死亡。与空白组比较，模型组大鼠粪便粒数、粪便含水量及炭末推进率均明显减少(

P

<0

.

05)；与模型组比较，苁蓉通便口服液组和电针治疗组大鼠粪便粒数、粪便含水量及炭末推进率均明显升高(

P

<0

.

05)。见表1。

表1 各组大鼠粪便粒数(n=10)、粪便含水量(n=10)及炭末推进率(n=5)比较

3.2 电针神阙穴对功能性便秘大鼠组织病理学的影响 空白组大鼠结肠组织未见明显病理变化。模型组大鼠结肠组织结构被破坏，黏膜层坏死较为明显，上皮基本脱落后缺失，固有层肠腺结构模糊，杯状细胞较少或基本不见，坏死区域及肠腔内可见坏死细胞碎片。苁蓉通便口服液组大鼠局部结肠组织结构被破坏，黏膜浅表变性坏死，见上皮坏死脱落，固有层内少量肠腺溶解坏死，坏死区域染色较浅，结构模糊。电针治疗组大鼠局部结肠组织结构被破坏，部分区域黏膜坏死，上皮缺失，固有层内少量肠腺结构模糊。见图1。

图1 各组大鼠结肠组织病理学变化(苏木精-伊红染色)

3.3 电针神阙穴对功能性便秘大鼠结肠MTL、GAS、SP含量的影响 与空白组比较，模型组大鼠结肠组织MTL、GAS、SP含量均明显降低(

P

<0

.

05)；与模型组比较，苁蓉通便口服液组和电针治疗组大鼠结肠组织MTL、GAS、SP含量均明显升高(

P

<0

.

05)。见表2。

表2 各组大鼠结肠运动指数功能比较

3.4 电针神阙穴对功能性便秘大鼠炎症因子水平的影响 与空白组比较，模型组大鼠结肠组织COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α含量均明显升高(

P

<0

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05)；与模型组比较，苁蓉通便口服液组和电针治疗组大鼠结肠组织COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α含量均明显降低(

P

<0

.

05)。见表3。

表3 各组大鼠炎症细胞因子水平比较

3.5 电针神阙穴对功能性便秘大鼠AQP3和NF-κB信号通路的影响 与空白组比较，模型组大鼠结肠组织AQP3 mRNA及其蛋白表达水平，CFTR、PKA、IκBα蛋白表达水平均明显降低(

P

<0

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05)，NF-κB p65 mRNA表达水平及p-NF-κB p65蛋白表达水平均明显升高(

P

<0

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05)；与模型组比较，苁蓉通便口服液组和电针治疗组大鼠结肠组织AQP3、CFTR、PKA、IκBα蛋白表达水平明显升高(

P

<0

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05)，NF-κB p65 mRNA表达水平明显降低(

P

<0

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05)，电针治疗组AQP3 mRNA表达水平明显升高(

P

<0

.

05)，而苁蓉通便口服液组AQP3 mRNA表达水平无明显变化(

P

>0

.

05)。见图2、图3、图4。

图2 Western blot法检测各组结肠组织AQP3、CFTR、PKA、p-NF-κB p65、IκBα蛋白表达水平

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

功能性便秘严重者可能导致躁动、呕吐、肠梗阻、穿孔，并可能与致命的肺栓塞或吸入有关。目前，20%～30%的60岁以上老年人每周需使用一种以上的泻药，含有番泻苷或氧化镁的药物有很强的通便活性，然而这些药物会产生不良反应，频繁使用可诱发结肠黑变病，这是结肠肿瘤的危险因素。研究显示，俞募配穴电针对功能性肠病具有双向调节作用。然而有关电针神阙穴对功能性便秘作用的报道较少。因此，本研究观察了电针神阙穴对功能性便秘大鼠组织病理学、结肠运动指数、炎症因子、AQP3和NF-κB信号通路的影响，以探讨电针神阙穴治疗功能性便秘的作用机制。

功能性便秘发病机制尚不十分清楚，可能与结肠动力改变、直肠功能障碍、胃肠神经分泌异常等因素有关，而这些因素不仅导致功能性便秘患者胃肠功能障碍，也会诱发全身性炎症免疫反应。孙伟义等报道，采用黄芪、肉苁蓉等清热解毒通腑汤灌肠可有效降低功能性便秘机械通气伴胃肠功能障碍患者IL-6、TNF-α含量，改善胃肠功能。在本研究中，模型组大鼠粪便粒数、粪便含水量、炭末推进率及结肠组织MTL、GAS、SP含量明显低于空白组，且结肠组织结构被破坏，黏膜层坏死较明显，而结肠组织COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α含量明显高于空白组，提示胃肠激素及炎症因子可能参与功能性便秘的进展。苁蓉通便口服液组和电针治疗组大鼠粪便粒数、粪便含水量、炭末推进率及结肠组织MTL、GAS、SP含量明显升高，结肠组织COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α含量明显降低，结肠炎症细胞浸润减少，可见电针神阙穴可以有效延缓结肠组织病变程度。研究显示，苁蓉通便口服液具有滋阴补肾、润肠通便、调节免疫、抗氧化、抗衰老及抗疲劳等功能，已被应用于便秘的治疗。本研究应用苁蓉通便口服液作为阳性对照，发现电针神阙穴与苁蓉通便口服液具有同等的调节作用。

有报道显示，AQP1—AQP4和AQP8在动物结肠黏膜上皮细胞中表达，且便秘的发病机制与结肠AQP的异常密切相关。Chao等证实AQP的异常表达可以影响结肠水代谢和肠道通透性的改变。本研究结果显示，电针神阙穴可明显升高结肠组织AQP3 mRNA和蛋白的表达水平，提示电针神阙穴上调结肠组织AQP3表达。环磷酸腺苷反应原件结合蛋白(cyclic adenosine monophosphate response element binding protein，CREB)的磷酸化是由PKA、丝裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶C和钙/钙调素依赖性蛋白激酶等蛋白激酶介导的，CREB的磷酸化可以促进AQP3的转录和表达。CFTR氯通道是驱动肠液分泌的主要途径，在维持管腔内容物的润滑中起重要作用。Harada等研究表明，麻仁丸可通过激活CFTR氯通道改善阿片类药物诱导的便秘。本研究结果显示，苁蓉通便口服液、电针神阙穴可上调PKA、CFTR的蛋白表达水平，与AQP3的上调趋势一致，可能共同起到治疗便秘的作用。

有研究结果显示，抑制NF-κB信号通路的激活可进一步促进AQP3的表达，NF-κB信号的激活对AQP2通道的下调非常重要。此外，IκBα与NF-κB结合组成NF-κB/IκBα复合体，以无活性的形式存在于细胞质中，激活的IKKβ靶向IκBα蛋白的丝氨酸残基，促使IκBα发生泛素化、磷酸化反应或降解，使得NF-κB游离并活化，游离的NF-κB能够调控IL-6、TNF-α等，进而加速疾病的进展。本研究结果发现，苁蓉通便口服液、电针神阙穴明显降低大鼠结肠组织NF-κB p65的表达水平，增加AQP3的表达水平，提示电针神阙穴增加AQP3的作用可能是通过下调NF-κB信号通路实现的。

综上所述，电针神阙穴可改善功能性便秘大鼠粪便含水量和肠道转运速率，改善结肠组织病理变化，其机制可能与调节AQP3、NF-κB信号通路有关。