DSPE-LC-MS/MS法测定泥鳅中16种喹诺酮类药物残留

唐秀 ，范广宇*，宋苏，梁夏夏，王文彬*，姚燕林

1. 江苏海洋大学（连云港 222005）；2. 连云港海关（连云港 222042）

泥鳅在我国分布广泛，其肉味道鲜美且富含优质蛋白质、脂肪酸、多种矿物元素及B族维生素，素有“水中人参”之美誉，具有较高的营养价值[1-2]，深受国内外消费者喜爱。江苏省连云港市作为全国泥鳅养殖和出口的重要地区，出口活泥鳅已有近20年的历史[3]，一直占据着韩国绝大部分市场份额。喹诺酮类（quinolones，QNs）药物具有抗菌谱广、抗菌力强、安全性高、价格低廉、毒副作用低等特性，被长期广泛应用于泥鳅养殖中，但使用不当会造成喹诺酮类药物在泥鳅体内残留，对人体构成潜在威胁。近年来韩国等主要进口国对泥鳅的药物残留要求越来越高，输往韩国的养殖水产品中诺氟沙星、培氟沙星和氧氟沙星的限量要求不得检出，据中国技术性贸易措施网数据，2017年以来韩国因喹诺酮类超标扣留我国出口泥鳅8批次。

目前，喹诺酮类药物检测常用的方法有免疫分析法[4-5]、毛细管电泳法[6]、液相色谱法[7-10]、液相色谱-串联质谱法[11-16]、液相色谱-高分辨质谱法[17]等。液相色谱-串联质谱法的分析时间短，检出限低，准确性和灵敏度高，在喹诺酮类药物残留检测中应用较广。泥鳅基质复杂，含有大量的脂肪、蛋白质、碳水化合物以及色素等杂质，仪器检测之前需要去除，处理不当将影响药物残留的检测，造成结果不准确、仪器污染等，因此样品的前处理尤为重要[18]。水产品中喹诺酮类药物残留检测广泛采用的前处理方法主要有固相萃取法[7,15,19,22]、液液萃取法[20]、分子印迹法[21]、加速溶剂萃取法[6,22]、分散固相萃取法[8,23-24]等。分散固相萃取（dispersive solid-phase extraction，DSPE）法是直接在提取液中加入固相吸附剂净化然后测定，具有快速、简单、灵活等特点，可用于不同性质药物的快速筛查。分散固相萃取法用于泥鳅中喹诺酮类药物检测的研究较少，此次试验基于分散固相萃取和高效液相色谱-串联质谱，建立一种同时检测泥鳅中16种喹诺酮类药物残留的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

QTRAP 4500液相色谱-串联质谱仪，美国AB SCIEX公司；Analyst工作站；XS 204分析天平，瑞士Mettler公司；KH-800KDB型高功率数控超声波，昆山禾创超声仪器有限公司；A10 Milli-Q超纯水机，美国Millipore公司；TDL-40B型离心机，上海安亭科学仪器厂；N-EVAP 112氮吹仪，美国Organomation公司；XW-80A型漩涡混合器，上海青浦沪西仪器厂。

恩诺沙星（enrofloxacin）、麻保沙星（marbofloxacin）、奥比沙星（orbifloxacin）、诺氟沙星（norfloxacin）、氟罗沙星（fleroxacin）、培氟沙星（pefloxacin）、氧氟沙星（ofloxacin）、司帕沙星（sparfloxacin）、丹诺沙星（danofloxacin）、依诺沙星（enoxacin）、萘啶酸（nalidixic acid）、氟甲喹（flumequine）、双氟沙星（difloxacin）、沙拉沙星（sarafloxacin）、环丙沙星（ciprofloxacin）、洛美沙星（lomefloxacin），德国Dr. Ehrenstorfer公司，纯度＞92%；环丙沙星-D8（ciprofloxacin-D8）、恩诺沙星-D5（enrofloxacin-D5）、诺氟沙星-D5（norfloxacin-D5）、培氟沙星-D5（pefloxacin-D5）、氧氟沙星-D3（ofloxacin-D3），德国Witega公司，纯度＞99%；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基键合硅胶吸附剂（C18），美国Agilent公司；中性氧化铝吸附剂（Alumina-N），上海安谱实验科技股份有限公司；硅镁型吸附剂（Florisil），上海润捷化学试剂有限公司；甲醇、乙腈，均为色谱纯，德国Merck公司；氯化钠、无水硫酸镁、无水硫酸钠、甲酸、乙酸，均为优级纯，中国国药试剂公司。试验用水为超纯水。样品购自本地市场。

1.2 标准溶液的配制

储备液：准确称取适量上述标准品，用甲醇溶解定容配制成100 mg/L的标准储备液。

混合标准溶液：分别取一定量的单标储备液，用初始流动相稀释成1 mg/L的16种喹诺酮类混合标准溶液和1 mg/L的5种氘代内标混合标准溶液，使用之前再稀释至所需浓度。

1.3 样品处理方法

准确称取5.0 g样品于50 mL离心管中，从1 mg/L的内标混合标准溶液中取25 μL加入样品中，加入10 mL含2%（V/V）乙酸的乙腈旋涡混匀，然后超声提取10 min，加入5 g无水Na2SO4旋涡混匀2 min，以3 500 r/min离心后取5 mL上清液氮吹至干，用1 mL甲醇-0.1%（V/V）甲酸水溶液溶解定容，加入60 mg PSA漩涡混匀1 min，以3 500 r/min离心后取上清液过0.22 μm滤膜，上机测定。

1.4 液相色谱条件

ACE UltraCore 2.5 Super C18柱（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）；柱温40 ℃；流速0.3 mL/min；进样体积5 μL；流动相，0.1%（V/V）甲酸水溶液（A）和甲醇（B）；梯度洗脱程序：0~3.5 min，10% B~35% B；3.5~6 min，35% B~90% B；6~7 min，90% B；7~7.1 min，90% B~10% B；7.1~10 min，10% B。

1.5 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描、多反应监测（MRM）模式；去溶剂温度（TEM）为500 ℃；电喷雾电压（IS）为5.5 kV；入口电压（EP）和碰撞室出口电压（CXP）分别为10和6 V；所用气体均为高纯氮气；碰撞气（CAD）、气帘气（CUR）、雾化气（GS1）、辅助气（GS2）的压力分别为41.4，207，345和345 kPa。16种喹诺酮类药物和5种氘代内标物的质谱参数见表1。

表1 16种喹诺酮类药物及5种内标物的保留时间、监测离子对、碰撞电压和去簇电压

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

考察了甲醇-0.1%（V/V）甲酸水溶液和乙腈-0.1%（V/V）甲酸水溶液作为流动相时目标化合物的响应值、分离效果和色谱峰形。结果表明，相比前者，后者色谱峰分离度和峰型不好，故选择甲醇-0.1%（V/V）甲酸水溶液作为流动相进行分离。在优化条件下，16种喹诺酮类药物的提取离子色谱图见图1。

图1 16种喹诺酮类药物的提取离子色谱图

2.2 质谱条件优化

采用直接进样方式注入0.1 mg/L的16种喹诺酮类药物的混合标准溶液和0.2 mg/L的5种氘代喹诺酮类内标混合标准溶液，ESI正离子模式下进行一级质谱分析，确定每种药物的母离子，再对母离子进行二级质谱扫描，选取两个相对丰度较高的碎片离子分别作为定量和定性离子，优化去簇电压和碰撞电压，优化后参数见表1。

2.3 提取条件的优化

乙腈有较好的去除蛋白质的作用，不仅对蛋白质具有良好的沉淀、去除效果，也对脂类、高疏水性化合物等杂质具有良好的去除效果，而泥鳅样品中的蛋白质含量较高，因此选择乙腈作为提取溶剂。试验对比了纯乙腈、2%乙酸-乙腈和2%甲酸-乙腈的提取效果，结果发现溶剂中加入酸后平均回收率明显增加，有助于目标检测物的提取。同时发现2%乙酸-乙腈和2%甲酸-乙腈的提取效果差别不大，考虑到甲酸的酸性和腐蚀性均大于乙酸，所以选取2%乙酸-乙腈作为提取溶剂。

试验还对比了超声0，5，10，15和20 min的提取效果，结果发现超声10 min即可得到最佳的回收率。

2.4 净化条件的选择

分散固相萃取法可以避免固相萃取柱繁琐和耗时的过程，因此选择分散固相萃取法对样品进行提取净化并研究净化条件的影响。对比了5 g无水Na2SO4、1 g NaCl+4 g无水Na2SO4、1 g NaCl+4 g无水MgSO4的影响，结果显示使用无水MgSO4回收率明显降低，而只加无水Na2SO4的平均回收率最好。

试验分别对比了100 mg PSA、100 mg C18、100 mg Florisil、100 mg Alumina-N、50 mg PSA+50 mg C18和50 mg PSA的净化效果，结果表明，单独使用PSA时的净化效果好于C18、Florisil和Alumina-N，PSA和C18同时使用时没有明显差异，因此选择单独使用PSA。

进一步对比了不同用量的PSA对目标化合物回收率的影响，结果见图2。当PSA用量达到60 mg时，回收率在70%~110%之间的目标化合物最多；当用量超过60 mg后，回收率低于70%的目标化合物明显增多，因此净化剂选取60 mg PSA。

2.5 方法学评价

2.5.1 标准曲线、线性关系、检出限和定量限

分别配制质量浓度为0.1，0.2，0.5，1，5，10和20 μg/L的标准溶液，内标溶液的质量浓度均为1 μg/L。以各目标物定量离子的峰面积与内标物定量离子的峰面积比为纵坐标（Y），各目标物质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，相关系数均大于0.995，线性关系良好。以S/N≥3确定检出限（LOD），以S/N≥10确定方法的定量限（LOQ），具体数值见表2。

表2 16种喹诺酮类药物的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限

2.5.2 精密度与回收率

采用空白泥鳅样品进行添加回收试验，加标水平分别为1，2和10倍定量限，按照1.3小节处理，每个水平重复测定6次，16种喹诺酮类药物的平均回收率为60.0%~112.2%，相对标准偏差为1.6%~13.3%，方法的回收率和精密度结果见表3。

表3 16种喹诺酮类药物的回收率和精密度（n=6）

2.5.3 实际样品测定

将该方法应用于18批泥鳅样品的检测，其中检出5批次恩诺沙星、2批次环丙沙星和2批次氧氟沙星，含量范围分别为0.5~28.5，0.7~6.3和0.2~0.6 μg/kg，说明泥鳅中喹诺酮类药物残留风险较大。

3 结论

利用分散固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法，建立同时检测泥鳅中16种喹诺酮类药物的分析方法。将该方法应用于泥鳅样品检测，其中有多批次样品检出喹诺酮类药物残留。该方法简便、快速、灵敏度高，能够对样品中的目标化合物进行准确的定性和定量分析，可用于泥鳅样品中16种喹诺酮类药物的快速检测，在提高泥鳅出口监管工作效率方面具有重要意义。