白背毛木耳多糖APP3a磷酸化修饰工艺及其抗氧化活性

张泽，吴欣怡，丁霄，张伟志，何京隆，陈义勇*

常熟理工学院生物与食品工程学院（常熟 215500）

白背毛木耳（Auricularia polytricha）属于真菌门担子菌纲[1]，多糖是白背毛木耳主要成分之一，研究表明白背毛木耳多糖（polysaccharides fromAuricularia polytricha，APP）具有抗肿瘤[2]、抗血栓、抗凝血、降血脂[3]等作用。用适当的手段对多糖进行结构上的化学修饰，对其生物活性有较大的影响[4-5]。对白背毛木耳多糖的研究主要集中在提取与纯化[6-8]、流变特性[9]、羧甲基化修饰[4]等方面，而对白背毛木耳多糖化学结构磷酸化修饰的研究还未见报道。

前期以白背毛木耳为原料，采用热水浸提法提取白背毛木耳多糖APP，通过离子交换柱层析和凝胶柱层析对APP进行纯化，得到1个白背毛木耳多糖单一组分APP3a[4]，因此以APP3a为对象，对APP3a磷酸化修饰工艺进行探讨，并利用响应面法对APP3a磷酸化修饰工艺条件进行优化，同时探讨磷酸化APP3a（phosphorylated APP3a，P-APP3a）的抗氧化活性，旨在为磷酸化白背毛木耳多糖的工业化制备奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

白背毛木耳毛多糖APP3a（实验室经过DEAEcellulose离子交换柱、葡聚糖G-200 凝胶柱分离纯化得到）；正丁醇、三氯甲烷、无水乙醇、三偏磷酸钠、三聚磷酸钠、浓硫酸、浓硝酸、盐酸、过氧化氢等（均为分析纯）；透析袋（截留分子量8 000~14 000，北京索莱宝科技有限公司）；1, 1-二苯基-2-苦苯肼/DPPH（上海楷洋生物技术有限公司）。

1.2 仪器和设备

HH-W4外循环四孔水浴锅（上海赫田科学仪器有限公司）；RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器有限公司）；立式循环水多用真空泵（巩义市予华仪器有限公司）；ZNCL-BS智能数显磁力搅拌器（上海越众仪器设备有限公司）；1700PC紫外可见分光光度计（上海奥析科学仪器有限公司）；NicoletIS10傅里叶红外光谱仪（美国Thermo Electron公司）；CR22GⅡ高速冷冻离心机（日本HITACHI公司）；Alpha 1-2 LD plus真空冷冻干燥机（德国CHRIST公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 P-APP3a的制备[10]

准确称取6 g多聚磷酸钠和1 g三偏磷酸钠，溶于100 mL蒸馏水中并搅拌均匀，与10 mg/mL的APP3a溶液混合，设定一定的pH、温度和时间进行反应，反应结束后将反应液透析48 h，透析完成后，向透析液中加入4倍无水乙醇醇沉48 h，离心弃去上清液，将沉淀冷冻干燥，得到P-APP3a备用。

1.3.2 磷酸根含量测定

采用钼蓝比色法[11]

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 磷酸化试剂比例对APP3a磷酸化反应的影响

取100 mg APP3a，设定磷酸化试剂比例（三聚磷酸钠和三偏磷酸钠质量比，g/g）1∶6，2∶5，3∶4，4∶3，5∶2和6∶1，在pH 9、反应时间2 h、反应温度80 ℃条件下反应，考察磷酸化试剂比例对APP3a磷酸化反应的影响。

1.3.3.2 反应温度对APP3a磷酸化反应的影响

取100 mg APP3a，设定反应温度40，50，60，70和80 ℃，在磷酸化试剂比例6∶1、pH 9、反应时间2 h条件下反应，考察反应温度对APP3a磷酸化反应的影响。

1.3.3.3 反应时间对APP3a磷酸化反应的影响

取100 mg APP3a，设定反应时间2，3，4，5和6 h，在磷酸化试剂比例6∶1、pH 9、反应温度80 ℃条件下，考察反应时间对APP3a磷酸化反应的影响。

1.3.3.4 反应pH对APP3a磷酸化反应的影响

取100 mg APP3a，设定反应pH 7，8，9，10和11，在磷酸化试剂比例6∶1、反应温度80 ℃、反应时间2 h条件下反应，考察反应pH对APP3a磷酸化反应的影响。

1.3.4 APP3a磷酸化反应最佳工艺确定

基于单因素试验结果，以磷酸化试剂比例、反应温度、反应时间、反应pH这4个因素为自变量，磷酸根含量为响应值，基于中心组合试验设计原理，设计四因素三水平的响应面分析试验，建立响应值与各个因素之间的函数关系，响应面法优化确定APP3a磷酸化反应最佳工艺。

1.3.5 红外光谱分析

分别取1 mg充分干燥的APP3a和P-APP3a，与1 mg溴化钾充分混匀并研磨后压片，进行红外光谱扫描（波数范围400~4 000 cm-1）。

1.3.6 抗氧化活性的测定

1.3.6.1 羟基自由基清除能力测定[12]

分别取FeSO4（9.0 mmoL/L）和水杨酸-乙醇溶液（9.0 mmoL/L）各1.0 mL于试管中，分别加入1 mL APP3a和1 mL P-APP3a溶液（质量浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL），充分摇匀后加入1 mL的H2O2溶液（9 mmoL/L）启动反应，于37 ℃水浴反应0.5h。将蒸馏水替代样品溶液作为对照组，测定A510值，进行3次平行试验，取平均值，羟基自由基的清除率按式（1）计算。

式中：A2为各浓度多糖样品的吸光度；A1为水杨酸被蒸馏水替代测定的吸光度；A0为各浓度多糖样品被蒸馏水替代测定的吸光度。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力测定[13]

将2 mL DPPH乙醇溶液（0.1 mmol/L），分别加入2 mL APP3a和2 mL P-APP3a溶液（质量浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL），充分摇匀后避光室温下反应30 min，用蒸馏水替代多糖溶液，作对照组，测定A517值，进行3次平行试验，取平均值，DPPH自由基清除率按式（2）计算。

式中：A2为各浓度多糖样品的吸光度；A1为DPPH被蒸馏水替代测定的吸光度；A0为多糖溶液被蒸馏水替代测定的吸光度。

1.3.6.3 超氧阴离子清除能力测定[14]

将4.5 mL Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L，pH 8.2）分别和1 mL APP3a、1 mL P-APP3a溶液（质量浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL）置于试管内，分别加入3.2 mL蒸馏水后混匀，于25 ℃水浴20 min，加入0.3 mL的邻苯三酚溶液（7 mmol/L），充分摇匀后放置于25 ℃水浴锅中反应3 min，即刻加1滴HCl溶液（10 mol/L）终止反应，测定A325值，进行3次平行试验，取平均值。超氧阴离子自由基清除率按式（3）计算。

式中：A为各浓度多糖溶液的吸光度；A0为以蒸馏水替代多糖样品测定的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 磷酸化试剂比例对APP3a磷酸化反应的影响

磷酸化试剂比例对APP3a磷酸化反应的影响见图1。磷酸化试剂比例对磷酸根含量的影响较为明显，三聚磷酸钠和三偏磷酸钠比例3∶4时，磷酸根含量达到最大值8.2%，因此适宜的磷酸化试剂比例确定为3∶4。

图1 磷酸化试剂比例对APP3a磷酸化反应的影响

2.1.2 反应温度对APP3a磷酸化反应的影响

反应温度对APP3a磷酸化反应的影响见图2。温度达到50 ℃时，磷酸根含量达到最大值4.655%。温度继续升高，磷酸根含量呈下降趋势，可能是由于温度过高导致多糖分子结构被破坏降解[10]，因此确定50 ℃作为适宜的反应温度。

图2 反应温度对APP3a磷酸化反应的影响

2.1.3 反应时间对APP3a磷酸化反应的影响

反应时间对APP3a磷酸化反应的影响如图3所示。随着时间延长，磷酸根含量逐步增加，反应时间5 h时，磷酸根含量达到最大值4.94%。反应时间进一步增加，磷酸根含量则减少，可能是多糖长时间高温下反应，会造成多糖降解导致磷酸根含量降低[10]，因此确定5 h作为适宜的反应时间。

图3 反应时间对APP3a磷酸化反应的影响

2.1.4 反应pH对APP3a磷酸化反应的影响

反应pH对APP3a磷酸化反应的影响见图4。随着反应pH增加，磷酸根含量呈现先升高再下降趋势，反应pH达到9时，磷酸根含量达到最大值4.78%。反应pH大于9，磷酸根含量则开始降低，这可能是由于磷酸化试剂在较低反应pH条件下会发生分解，而反应pH过高会导致磷酸化试剂与多糖发生反应，从而影响磷酸化效果[15]。因此适宜的反应pH确定为9。

图4 反应pH对APP3a磷酸化反应的影响

2.2 APP3a磷酸化工艺条件优化

2.2.1 响应面模型的建立与分析

基于单因素试验结果，以磷酸根含量为响应值，以反应时间、反应温度、反应pH和磷酸化试剂比例为主要要素，设计四因素三水平的组合试验，将因素与响应值之间的函数关系通过回归方程拟合，响应面分析试验因素与水平见表1，响应面设计及结果见表2，通过Design-Expert 8.05系统对试验结果进行方差分析，结果见表3。

表1 响应面分析试验因素与水平

表2 响应面试验设计及结果

通过Design-Expert软件响应面试验结果数据进行拟合，得到响应值磷酸根含量（R）与自变量磷酸化试剂比例（A）、反应温度（B）、反应时间（C）、反应pH（D）之间的二次多项回归方程的模型：R=7.34+0.42A-0.63B+0.19C-0.028D-0.41AB-0.034AC-0.073AD+0.043BC-0.15BD-0.12CD-0.48A2-2.12B2-0.80C2-1.44D2。

从表3回归模型方差分析可以看出，该模型的F值为9.31，p＜0.000 1，表明拟合得到的模型极显著。因素磷酸化试剂比例（A）和反应温度（B）均具有显著水平（p＜0.05），其中反应温度对响应值的影响最大，因素影响程度大小顺序为反应温度（B）＞磷酸化试剂比例（A）＞反应时间（C）＞反应pH（D）。

表3 回归模型方差分析

2.2.2 响应面图形分析

两因素的交互作用对APP3a磷酸化反应的影响结果见图5。温度对APP3a磷酸化反应的影响最为显著，表现为曲线最陡，磷酸化试剂比例的影响次之，反应pH曲线最平滑，影响最不显著。反应温度和磷酸化试剂比例之间的交互作用对APP3a磷酸化反应的影响最明显，其次是磷酸化试剂比例（A）和反应pH（D）的交互作用。磷酸化试剂比例（A）和反应pH（D）间的交互作用及反应温度（B）和反应时间（C）间的交互作用对APP3a磷酸化反应的影响不明显。

图5 两因素的交互作用对APP3a磷酸化反应的影响

2.2.3 模型的优化和验证

采用Design-Expert 8.05软件分析响应面数据，可以预测得到APP3a磷酸化反应最佳工艺条件：磷酸化试剂比例3.49∶3.51、反应温度50.32 ℃、反应时间5.07 h、反应pH 9.13。在此条件下，磷酸根含量为7.47%。为实际操作的方便性，调整APP3a磷酸化反应条件为磷酸化试剂比例3∶4、反应温度50 ℃、反应时间5 h、反应pH 9.0。通过3次平行验证试验，得到的磷酸根含量平均值为7.41%，实际值和预测值相近，表明该模型能够充分预测APP3a磷酸化反应因素与磷酸根含量间的关系，证明反应工艺参数的可行性。

2.3 红外光谱分析

APP3a与P-APP3a的红外光谱图如图6所示。APP3a和P-APP3a均有多糖类物质红外特征峰，在3 413.555 cm-1波数处出现—OH的伸缩振动吸收峰，在1 386.636 cm-1波数处出现C＝O的伸缩振动峰，在1 284.422 cm-1波数处出现P＝O伸缩振动峰，在1 079.995 cm-1波数附近出P—O—C的伸缩振动峰，由此可知APP3a磷酸化修饰成功。

图6 APP3a和P-APP3a的红外光谱

2.4 APP3a和P-APP3a的抗氧化作用

2.4.1 羟基自由基的清除作用

APP3a和P-APP3a对羟基自由基的清除作用见图7。在一定的多糖浓度范围内，随着多糖浓度提高，APP3a和P-APP3a对羟基自由基的清除作用逐步增加，与APP3a相比，在同等浓度条件下，经过磷酸化修饰的P-APP3a对羟基自由基的清除作用明显增强，说明对APP3a磷酸化修饰能进一步提高对羟基自由基的清除能力。

图7 APP3a和P-APP3a对羟基自由基的清除作用

2.4.2 DPPH自由基的清除作用

APP3a和P-APP3a对DPPH自由基的清除作用见图8。在一定的多糖浓度范围内，随着多糖浓度提高，APP3a和P-APP3a对DPPH自由基的清除作用逐步增加，与APP3a相比，在同等浓度条件下，经过磷酸化修饰的P-APP3a对DPPH自由基的清除作用有一定程度的减弱，可能是因为磷酸化多糖构象发生改变，导致生物活性发生变化[16]。

图8 APP3a和P-APP3a对DPPH自由基的清除作用

2.4.3 超氧阴离子自由基的清除作用

APP3a和P-APP3a对超氧阴离子自由基的清除作用如图9所示。在一定质量浓度范围内，随着多糖浓度提高，APP3a和P-APP3a对超氧阴离子自由基的清除作用逐步增加，与APP3a相比，在同等浓度条件下，经过磷酸化修饰的P-APP3a对超氧阴离子自由基有一定程度的增强，这可能是因为经磷酸化的多糖水溶性提高，导致抗氧化性增强[16]。

图9 APP3a和P-APP3a对超氧阴离子自由基的清除作用

3 结论

以前期分离得到的白背毛木耳多糖单一组分APP3a为对象，对APP3a磷酸化修饰工艺进行探讨，利用响应面法对APP3a磷酸化修饰工艺条件进行优化，探讨P-APP3a的抗氧化活性。确定APP3a磷酸化修饰工艺条件：磷酸化试剂比例3∶4、反应温度50 ℃、反应时间5 h、反应pH 9.0。在一定的浓度范围内，随着APP3a和P-APP3a浓度的提高，它们对羟基自由基、DPPH自由基及超氧阴离子自由基清除作用增强，在同等浓度条件下，与APP3a相比，P-APP3a羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力显著加强，而对DPPH自由基清除能力有所减弱。白背毛木耳多糖经过磷酸化修饰后导致分子结构发生改变，从而导致其抗氧化活性发生变化，但是磷酸化白背毛木耳多糖抗氧化作用机理还不清楚，还需要进一步深入研究。