槲皮素对5-FU诱导的结直肠癌SW480细胞耐药及自噬调控机制研究

林增海，陆 军，王凯松

(汕头大学医学院第一附属医院肝胆外科，广东 汕头 515041)

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是一种常见的胃肠道恶性肿瘤，发病率居全球恶性肿瘤的第3位[1]。CRC早期缺乏明显症状，一旦出现便血、腹痛等症状，病程已经达到中晚期，临床主要采用手术联合放化疗清除病灶组织，延长患者生存期，但术后复发率较高[2]。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)是临床常用的CRC化疗药物之一，可以有效杀灭或抑制消化道肿瘤细胞，但其长期应用可诱导肿瘤细胞的耐药性，导致临床治疗失败[3]。分析CRC的发病机制，从天然植物中寻找有效的抗癌药物，受到了研究者们的广泛关注。槲皮素(Quercetin，Que)是一种广泛存在于天然植物中的黄酮类化合物，具有多种生物学功能，包括抗氧化、抗菌、抗炎、降血压等，可以延缓衰老，在心血管疾病的防治中具有重要应用价值[4]。近年来研究发现，Que具有抗肿瘤作用，可以抑制癌细胞增殖，诱导细胞自噬和凋亡，还可以逆转化疗药物的耐药性，协同抑制多种恶性肿瘤的生长[5-6]。但Que对CRC的作用及其机制尚不清楚。因此，本研究探讨了Que对5-FU诱导的CRC细胞耐药及自噬的调控机制，旨在为Que在CRC治疗中的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 多功能酶标检测仪(iMark680)购自美国Bio-Rad公司；荧光显微镜(IX73型)购自日本Olympus公司；SW480细胞购自中科院上海细胞库；5-FU(批号F6627，质量分数≥99.0%)、Que(批号87K0744，质量分数≥98%)购自美国Sigma公司；MTT、TUNEL检测试剂盒均购自上海经科化学科技有限公司；兔抗人p糖蛋白(P-glycoprotein，Pgp)、多药耐药相关蛋白1(Multidrug resistance associated protein 1，MRP1)、三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2抗体(ATP-binding transporter G cassette transporer G2，ABCG2)、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、丝/苏氨酸激酶(silk/threonine kinase，AKT)、p-AKT、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、p-mTOR单克隆抗体，均购于美国Santa Cruz公司；β-actin和辣根过氧化酶(Horseradish peroxidase，HRP)标记羊抗兔IgG，购于丹麦DAKO公司。

1.2 5-FU耐药细胞株建立 含质量分数为10%热灭活胎牛血清的DMEM培养液接种SW480细胞，37 ℃、5%CO2培养箱中培养过夜。采用浓度递增诱导法建立5-FU耐药细胞株，取对数期细胞制成单细胞悬液，加入5-FU溶液(终浓度为10 μg/ml)，培养过夜，而后加入浓度递增的5-FU(每次增加10 μg/ml)，反复处理细胞，直到细胞能耐受最大5-FU浓度(40 μg/ml)，则耐药细胞株SW480/5-FU构建成功。

1.3 SW480/5-FU细胞株的耐药性检测 取对数生长期SW480和耐药株SW480/5-FU细胞，制成单细胞悬液，两组均加入含5-FU(终浓度分别为0、2.5、5、10、20、40、80、160和320 μg/ml)的培养基，培养24 h，弃培养液，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，培养4 h，弃培养液，加入150 μl二甲基亚砜作用30 min，全自动酶标仪检测490 nm波长吸光度值，分析半抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration，IC50)，计算细胞的耐药指数(Resistance index，RI)=IC50(SW480/5-FU)/IC50(SW480)。

1.4 Que的剂量筛选和分组 取对数生长期耐药株SW480/5-FU细胞，制成单细胞悬液，两组均加入Que(终浓度分别为0、2.5、5、10、20、40、80、160和320 μmol/L)的培养基，培养24 h，MTT法检测各组细胞抑制率。设置Que高、中、低剂量组(10、20、40 μmol/L)和对照组(0 μmol/L)。

1.5 Que对耐药株SW480/5-FU细胞5-FU耐药性的影响 取各组与相应药物孵育24 h的SW480/5-FU细胞，制成单细胞悬液，以1×105个/ml接种于96孔板，加入含5-FU(终浓度分别为0、2.5、5、10、20、40、80、160和320 μg/ml)的培养基，继续培养24 h，MTT法检测各组细胞的IC50，计算耐药逆转倍数=Que干预前IC50/Que干预后IC50。

1.6 TUNEL染色法检测细胞凋亡 取各组与相应药物孵育24 h的SW480/5-FU细胞，制作细胞涂片。经4%多聚甲醛固定后，依次分别进行TUNEL染色，DAPI染色，荧光显微镜下观察计数细胞凋亡率，严格按照TUNEL试剂盒说明操作染色。

1.7 免疫荧光检测细胞自噬活性 取各组与相应药物孵育48 h的SW480/5-FU细胞，弃培养基，经质量分数4%的甲醛固定10 min，200 μl的Triton-X室温通透30 min，3%的BSA封闭1 h，加入一抗(LC3，稀释比例1∶400)孵育过夜，加入荧光耦联二抗，37 ℃孵育1 h，荧光显微镜下观察LC3荧光斑点数。

1.8 Western blot检测细胞耐药和自噬相关蛋白以及AKT/mTOR的磷酸化 取各组与相应药物孵育24 h的SW480/5-FU细胞，提取总蛋白并进行蛋白定量，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，室温封闭2 h，加一抗(P-gp、MRP1、ABCG2、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62、AKT、p-AKT、mTOR、mTOR，稀释比例均为1∶1000，β-actin为内参)，4 ℃孵育过夜，洗膜加二抗(稀释比例为1∶5000)，室温孵育2 h，电化学发光显影，分析对比条带强弱。

2 结 果

2.1 SW480/5-FU细胞的5-FU耐药性 MTT结果显示(图1)，5-FU对SW480细胞和SW480/5-FU细胞的抑制作用呈药物浓度依赖性，IC50分别为(32.20±5.71)μg/ml和(442.34±56.41)μg/ml。5-FU抑制SW480/5-FU细胞的IC50明显高于SW480细胞(P<0.05)，RI=13.74。

图1 SW480/5-FU细胞的5-FU耐药性

2.2 Que对SW480/5-FU细胞增殖活性的影响 MTT结果显示(图2)，Que对SW480/5-FU细胞的抑制作用呈药物浓度依赖性，随着Que浓度增加，当Que浓度为20 μmol/L时，细胞抑制率明显升高(P<0.05)。因此，设置Que低、中、高剂量组的浓度分别为10、20、40 μmol/L。

注：与0 μmol/L Que作用相比，*P<0.05

2.3 Que对SW480/5-FU细胞耐药性的影响 MTT结果显示(图3)，与对照组相比，Que中、高剂量组5-FU抑制SW480/5-FU细胞的IC50明显下降(P<0.05)，耐药逆转倍数分别为2.27、4.03。

注：与对照组相比，*P<0.05

2.4 Que对SW480/5-FU细胞耐药相关蛋白表达的影响 Western blot检测结果显示(图4)，与对照组相比，Que中、高剂量组SW480/5-FU细胞的P-gp、MRP1、ABCG2蛋白表达明显下降(P<0.05)。

1：对照组；2：Que低剂量组；3：Que中剂量组；4：Que高剂量组。与对照组相比，*P<0.05

2.5 Que对SW480/5-FU细胞凋亡的影响 TUNEL染色结果显示(图5)，与对照组相比，Que中、高剂量组SW480/5-FU细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。

2.6 Que对SW480/5-FU细胞自噬活性及相关蛋白表达的影响 Western blot检测结果显示(图6)，与对照组相比，Que中、高剂量组SW480/5-FU细胞的自噬活性明显增强，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的表达明显升高，p62蛋白表达明显下降(P<0.05)。

图5 Que对SW480/5-FU细胞凋亡的影响

A：免疫荧光检测细胞自噬活性；B：Western blot检测自噬相关蛋白表达。1：对照组；2：Que低剂量组；3：Que中剂量组；4：Que高剂量组。与对照组相比，*P<0.05

2.7 Que对SW480/5-FU细胞AKT/mTOR磷酸化的影响 Western blot检测结果显示(图7)，与对照组相比，Que中、高剂量组SW480/5-FU细胞p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白表达明显下降(P<0.05)。

1：对照组；2：Que低剂量组；3：Que中剂量组；4：Que高剂量组。与对照组相比，*P<0.05

3 讨 论

CRC起源于结直肠黏膜上皮，早期无典型症状，随病情进展，可出现腹泻、便血、局部腹痛等，临床主要采用手术联合放化疗[7]。5-FU是临床常用的CRC化疗药物之一，可以诱导肿瘤细胞凋亡，但其长期应用可诱导SW480细胞耐药，导致临床治疗失败[8]。Que是一种天然化合物，可以作用于CRC的发生和进展阶段，发挥抗肿瘤作用，还可以逆转肿瘤细胞的化疗耐药性，抑制多种CRC的发生发展[9-10]。本研究中，5-FU对SW480细胞和SW480/5-FU细胞的抑制作用呈药物浓度依赖性，5-FU抑制SW480/5-FU细胞的IC50明显高于SW480细胞，RI为13.74，提示SW480/5-FU细胞株对5-FU表现出明显的耐药性，可用于后续实验研究。本研究中，Que对SW480/5-FU细胞的抑制作用呈药物浓度依赖性，随着Que浓度增加，当Que浓度为20 μmol/L时，细胞抑制率和凋亡率明显升高。Feng等[11]研究显示，Que可以抑制SW480细胞增殖，诱导细胞凋亡，本研究结果与其类似，提示Que可以以剂量依赖性的方式抑制5-FU诱导耐药SW480细胞增殖，诱导细胞凋亡，可用于临床辅助治疗。研究显示[12-13]，Que可以参与调控肿瘤细胞的化疗耐药性、自噬、凋亡等多种信号通路蛋白的表达，发挥抗肿瘤作用。因此，本研究进一步分析Que对SW480细胞的5-FU耐药性和自噬的影响，旨在为Que的临床应用和新药研发提供理论依据。

本研究中，与对照组相比，Que中、高剂量组5-FU抑制SW480/5-FU细胞的IC50明显下降，且低、中、高剂量Que对SW480/5-FU细胞的耐药逆转倍数分别为1.08、2.27和4.03，提示Que可以以剂量依赖性的方式逆转SW480/5-FU细胞的耐药性。本研究中，与对照组相比，Que中、高剂量组SW480/5-FU细胞的P-gp、MRP1、ABCG2蛋白表达明显下降。P-gp、MRP1、ABCG2均为肿瘤细胞常见的多药耐药蛋白，其表达上调可以通过降低细胞内的药物浓度，抑制化疗药物的毒性作用等，提高肿瘤细胞对化疗耐药的耐受性[14-15]。何海兰等[16]研究显示，Que可以抑制P-gp和MRP1表达，逆转SW480对奥沙利铂的耐药性，提示Que以剂量依赖性的方式下调耐药相关蛋白P-gp、MRP1、ABCG2的表达，逆转SW480/5-FU细胞的耐药性。

自噬是一种不依赖Caspase的细胞死亡途径，可以与溶酶体融合，清除细胞内的多余蛋白、损伤细胞器，在肿瘤的进展中发挥重要作用[17]。本研究中，与对照组相比，Que中、高剂量组SW480/5-FU细胞的自噬活性明显增强，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的表达均明显升高，p62蛋白表达明显下降，提示Que可以呈剂量依赖性的促进细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达，抑制p62蛋白表达，增强细胞的自噬活性。LC3是一种自噬体标志蛋白，在自噬过程中，LC3Ⅰ会被修饰和加工为一种膜结合形式即LC3Ⅱ，并定位到自噬小体，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可以很好的反映细胞的自噬活性[18]，提示Que可以呈剂量依赖性的增强SW480/5-FU细胞自噬活性。p62是细胞自噬的特异性降解底物，可以与LC3相互作用，并通过自噬-溶酶体系统降解，其表达水平可以反映细胞的自噬活性[19]，提示Que可以抑制SW480/5-FU细胞的自噬降解，进一步促进自噬。Wang等[20]的研究显示，Que可以促进LC3Ⅰ/Ⅱ转换，诱导肝癌细胞自噬性死亡和凋亡，从而发挥抗肿瘤作用，提示Que可以通过增强SW480/5-FU细胞自噬活性，诱导细胞死亡，有望应用于临床抗肿瘤辅助治疗。Huang等[21]研究显示，肿瘤细胞化疗耐药性与细胞的过度自噬有关，热激因子1、氧自由基等介导的过度自噬可以诱导肿瘤细胞耐药，而过度的自噬亦可通过调节细胞内Met等表达，逆转耐药性，提示Que可以通过增强SW480/5-FU细胞自噬活性，逆转细胞耐药性，但其具体的作用及机制尚有待于进一步研究。本研究结果发现，与对照组相比，Que中、高剂量组SW480/5-FU细胞内AKT和mTOR的磷酸化水平明显下降。AKT/mTOR信号通路是机体调节细胞自噬的重要信号通路[22]。Lan等[23]研究显示，Que可以抑制AKT/mTOR的磷酸化，诱导肿瘤细胞的自噬性死亡，提示Que诱导SW480/5-FU细胞的自噬性死亡可能与被抑制的AKT/mTOR信号通路有关。

综上所述，Que可以以剂量依赖性的方式抑制细胞增殖，诱导凋亡，逆转SW480/5-FU细胞的5-FU耐药性，还可以诱导SW480/5-FU细胞的自噬性死亡，其作用机制可能与被抑制的AKT/mTOR信号通路有关，有望应用于临床治疗。但本研究尚处于初步探索阶段，其具体的作用机制尚需进一步验证。