低温胁迫及恢复对番茄快速叶绿素荧光诱导动力学特征的影响*

2021-10-20胡文海胡雪华闫小红周升团

中国农业气象 2021年10期

胡文海，胡雪华，闫小红，周升团

（井冈山大学生命科学学院/江西省生物多样性与生态工程重点实验室，吉安 343009）

低温是许多热带和亚热带作物生长发育的主要限制因子。随着现代农业的迅速发展，设施园艺得到广泛应用，使得番茄等喜温蔬菜的周年生产成为可能。但中国农业生产上仍以保温型设施为主，其环境可控性相对较差，低温仍然是影响冬春季节蔬菜设施栽培的重要环境因子。光合作用决定了作物的生长和产量，对低温极为敏感[1]。因此，研究低温及随后恢复期作物叶片叶绿素荧光的变化，以探究光合机构对低温的响应，对于制定适宜的蔬菜设施栽培措施具有实践指导意义。

国内外关于低温对番茄等蔬菜作物光合作用的影响已有广泛研究。研究表明，低温导致了作物叶片叶绿素含量[2]、光合酶活性[3-4]和PSII 光化学效率[5]的降低，限制了光合作用的进行。光合碳同化能力的降低减少了Calvin 循环对还原力（ATP 和NADPH）的需求，从而阻碍了光合电子传递的顺利进行[6]；而电子传递链的过度还原促进了叶绿体内活性氧产率，增加了叶片光抑制甚至光氧化的风险[7-8]。虽然植物低温光抑制方面有较多研究，但植物PSII 原初光化学反应及光合机构状态对低温胁迫响应方面的研究仍较少。有报道低温可以破坏包括类囊体电子传递在内的光合作用所有主要成分，阻碍了光合电子传递的进行[1]。低温可导致辣椒和玉米叶片PSII 反应中心失活[9-10]，影响了辣椒叶片PSII的光能吸收、转换和受体侧的电子传递[11]，阻碍了丁香属植物紫丁香（Syringa oblata）和暴马丁香（Syringa reticulate）叶片PSII 反应中心受体侧QA到QB的电子传递过程[12]。

番茄（Solanum lycopersicum）作为重要的喜温蔬菜，在冬春季节的设施栽培中常遭遇低温胁迫，并严重影响其产量和品质[13-14]。低温可导致番茄叶片PSII 反应中心失活，但PSI 侧的电子传递链被激活[15]。然而，番茄叶片PSII 反应中心及其受体侧的电子传递对低温处理及随后恢复期，尤其是低温处理第1 天和恢复第1 天这两个光温变化剧烈的转换期，光温变化的响应仍不清楚。快速叶绿素荧光诱导动力学分析（JIP-test）是以生物膜能量流动为基础建立的分析方法，能够获得环境条件对PSII 反应中心光能吸收、转换以及电子传递体氧化还原状态的影响[16-17]。为此，本研究以番茄为材料，研究低温胁迫及随后恢复期番茄叶片快速叶绿素荧光诱导动力学特性的动态变化，以期为番茄冬春季节的设施栽培和低温逆境生理研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验设计

试验于2019年9-11月在井冈山大学生命科学学院实验室进行。供试番茄品种为中蔬4 号（Solanum lycopersicumL.cv Zhongshu No.4）。将番茄种子播种于直径为10cm 的圆形塑料花盆中，培养基质为草碳土，浇灌园试营养液进行水肥管理，置于人工气候室内培养。长至6 叶1 心时，选取长势基本一致的植株开展试验。实验期间人工气候室温度变化范围在18～28℃，空气相对湿度约75%，采用LED 植物生长灯提供约600μmol·m-2·s-1的光照，光照时间7：00-19：00。

实验共设2 个处理，（1）对照（CK）：植株置于人工气候室内生长；（2）低温处理（CL）：植株置于人工气候箱（ZRY-YY1000，宁波）中培养，设置温度 8℃，空气相对湿度为 75%，光照强度约为200μmol·m-2·s-1，光照时间7：00-19：00。处理从2019年11月1日7：00 开始，将盆栽番茄由人工气候室移入人工气候箱进行低温处理，4d 后（11月5日7：00）将低温处理植株从人工气候箱转移至人工气候室内恢复培养4d。

1.2 观测项目

叶绿素荧光诱导动力学曲线（OJIP）采用便携式植物效率仪Handy-PEA（Hansatech，英国）测定。每处理5 株，每株选取顶端第1 片完全展开叶为测定对象，分别于11月1日（处理第1 天）和5日（恢复第1 天）的7：00（0h）、8：00（1h）、13：00（6h）和19：00（12h），以及第2、3、4、6、7、8日的7：00 进行OJIP 曲线测定。叶片测定前暗适应30min，OJIP 曲线由1500μmol·m-2·s-1红光诱导，测定时间为2s，将获得的OJIP 曲线进行JIP-test 分析。

测量可得到以下荧光参数：最大光化学效率（Fv/Fm）；潜在光化学效率（Fv/Fo）；以吸收光能为基础的性能指数（PIABS）；综合性能指数（PItotal）；OJIP 荧光诱导曲线的初始斜率（Mo）；标准化后的OJIP 荧光诱导曲线及y 轴围成的面积（Sm）；捕获的激子将电子传递到电子传递链中超过QA的其它电子受体的概率（ψo）；用于电子传递的量子产额（φEo）；用于热耗散的量子比率（φDo）；用于还原PSI 受体侧末端电子受体的量子产额（φRo）；单位面积吸收的光能（ABS/CS）；单位面积捕获的光能（TRo/CS）；单位面积电子传递的量子产额（ETo/CS）；单位面积的热耗散（DIo/CS）；单位面积有活性的反应中心数量（RC/CS）；单位反应中心吸收的光能（ABS/RC）；单位反应中心捕获的用于还原QA的能量（TRo/RC）；单位反应中心捕获的用于电子传递的能量（ETo/RC）；单位反应中心耗散掉的能量（DIo/RC）[16,18]。

1.3 数据处理

数据分析及图表绘制采用Origin8.5 及Microsoft Excel 2010。JIP-test 参数逐日变化图由实验期间11月1-8日7：00 所测得叶片OJIP 曲线的JIP-test 参数绘制而成，低温处理第1 天JIP-test 参数变化图由11月1日7：00（0h）、8：00（1h）、13：00（6h）、19：00（12h）和2日7：00（24h）所测得叶片OJIP曲线的JIP-test 参数绘制而成，恢复第1 天JIP-test参数变化图由11月5日7：00（0h）、8：00（1h）、13：00（6h）、19：00（12h）和6日7：00（24h）测得叶片OJIP 曲线的JIP-test 参数绘制而成。数据均为平均值±标准误，n=5。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫及恢复对PSII光化学效率和光合性能指数的影响

Fv/Fm 和Fv/Fo 分别代表PSII 的最大光化学效率和潜在光化学效率，PIABS和PItotal分别代表以吸收光能为基础的性能指数和综合性能指数。由图1 可见，与对照相比，低温处理1d 导致Fv/Fm 下降了34.0%，处理2d 下降45.0%，随后两天Fv/Fm 值维持在0.4左右波动；而低温处理1d即导致Fv/Fo、PIABS和PItotal分别快速下降71.1%、94.7%和96.1%，并一直维持在极低水平。低温处理第1 天，Fv/Fm 与Fv/Fo呈现了相同的变化趋势，处理1h 时Fv/Fm 和Fv/Fo并未发生明显变化，6h 后才有明显下降，但Fv/Fo的下降幅度大于Fv/Fm；而低温处理1h 即导致PIABS和PItotal下降了48.5%和50.5%，处理6h 持续下降。说明低温严重抑制了番茄叶片的光化学效率和光合性能，且光合性能对低温极为敏感，先于光抑制显著降低。

图1 人工气候室中对照处理（CK）和人工气候箱中低温处理（CL）番茄叶片PSII 光化学效率和光合性能指数的比较Fig.1 Comparison of the quantum efficiency of PSII and photosynthetic performance index in leaves of tomato exposed to control treatment (CK, cultured in artificial climate chamber) and chilling treatment (CL, cultured in artificial climate box)

恢复期，Fv/Fm、Fv/Fo、PIABS和PItotal均随着恢复时间的延长而得以恢复。Fv/Fm 和Fv/Fo 的恢复速率相对更快，第1 天即可恢复至对照的82.5%和49.6%，第4 天时分别恢复至对照的93.3%和73.9%。而PIABS和PItotal恢复第1 天仅为对照的21.7%和16.3%，第4 天时也仅恢复至对照的46.3%和55.3%。恢复的第1 天，光下恢复1h 仍引起Fv/Fm 小幅下降，但恢复6h 后Fv/Fm 即恢复至对照的67.1%；而PIABS虽然随着恢复时间的延长而缓慢上升，但一直保持较低水平。

2.2 低温胁迫及恢复对PSII 受体侧的影响

Mo 代表OJIP 荧光诱导曲线的初始斜率，Sm 代表标准化后的OJIP 荧光诱导曲线及y 轴围成的面积，ψo代表捕获的激子将电子传递到电子传递链中超过QA的其它电子受体的概率，φEo 代表用于电子传递的量子产额，φDo 代表用于热耗散的量子比率，φRo 代表用于还原PSI 受体侧末端电子受体的量子产额。由图2 可见，低温处理导致Mo、Sm 和φDo的增加，其中Mo 迅速上升后有所下降，Sm 则是从处理第2 天后才大幅上升，而φDo 在处理前2d 持续上升后，随后两天维持稳定状态。低温处理导致Ψo、 φEo 和φRo 的下降，其中Ψo 在快速下降后又有所上升，φEo 和φRo 则在处理1d 时即大幅下降并一直维持极低水平。恢复过程中，Sm 在恢复第1 天即可迅速恢复至对照水平；Ψo、φEo、φDo 和φRo也随着恢复时间延长而得以大幅恢复，但第4 天均未达到对照水平；而Mo 则在恢复前2 天还有所上升，随后才缓慢下降，在恢复的第4 天仍显著高于对照。

图2 两处理番茄叶片PSII 受体侧JIP-test 参数的比较Fig.2 Comparison of the JIP-test parameters for the PSII receptor side in leaves between two treatments

光照条件下低温处理1h 即引起Mo 和Sm 的上升，且后期基本维持不变，而φDo 在处理1h 时并未有明显变化，处理6h 后φDo 大幅上升，随后维持不变；随后的黑暗低温处理12h 又引起Mo 和φDo 大幅上升，而Sm 则稍有下降。Ψo、φEo 和φRo 则均呈现低温处理1h 即明显下降，处理6h 仍大幅下降随后维持不变，而黑暗低温处理12h 又引起Ψo、φEo和φRo 的下降。

光下恢复1h 仍引起Mo 迅速大幅上升，暗中恢复则有利于Mo 的下降；Sm 在恢复1h 后即下降至低于对照水平，随后逐渐恢复至对照水平；φDo 在光下恢复1h 时仍有所上升，随着恢复时间的延长而逐渐下降，但始终高于对照水平。光下恢复1h 也造成了Ψo、φEo 和φRo 的下降，随后均随着恢复时间的延长而缓慢上升，其中Ψo 的恢复速率最大，但三者在恢复24h 后均未达到对照水平。

2.3 低温胁迫及恢复对PSII 反应中心的影响

ABS/CS 代表单位面积吸收的光能，TRo/CS 代表单位面积捕获的光能，ETo/CS 代表单位面积电子传递的量子产额，DIo/CS 代表单位面积的热耗散。由图3 可知，低温处理1d 即导致番茄叶片ABS/CS、TRo/CS、ETo/CS 显著下降，下降幅度分别为43.7%、62.4%和82.6%，但是低温1h 仅导致ETo/CS 下降，未引起ABS/CS 和TRo/CS 变化。低温诱导了DIo/CS的上升，低温1h 后DIo/CS 上升了24.5%。ABS/CS、TRo/CS、ETo/CS 恢复1d 即分别达到对照的80.9%、67.4%和57.8%。ABS/CS 和TRo/CS 在恢复第2 天可恢复至对照水平，随后虽稍有下降，但在恢复第4天分别为对照的91.0%和85.3%。ETo/CS 在4d 恢复期内不能完全恢复至对照水平，仅达到对照的77.8%。在恢复的第1 天，前1h 未引起ABS/CS、TRo/CS、ETo/CS 的恢复，随后随着恢复时间延长而迅速上升。DIo/CS 在恢复第1 天仍维持低温处理下的较高水平，第2 天反而大幅增加，随后又快速下降，在恢复第4 天时仍比对照高16.9%。

图3 两处理番茄叶片单位面积比活性参数的比较Fig.3 Comparison of the specific energy fluxes per cross section(CS) in leaves between two treatments

RC/CS 代表单位面积有活性的反应中心数量，ABS/RC 代表单位反应中心吸收的光能，TRo/RC 代表单位反应中心捕获的用于还原QA的能量，ETo/RC代表单位反应中心捕获的用于电子传递的能量，DIo/RC 代表单位反应中心耗散掉的能量。由图4 可知，低温导致番茄叶片RC/CS 显著下降，但低温1h反而诱导其小幅上升；由低温转移至室温下，虽然RC/CS 能够快速恢复，但恢复4d 仍未达到对照水平，并且恢复1h 时还稍有下降。低温处理期，低温促进了ABS/RC 和DIo/RC 增强，导致TRo/RC 和ETo/RC的下降，且ETo/RC 的降低幅度明显大于TRo/RC。低温处理第1 天，处理前12h 内并未引起ABS/RC的变化，但诱导了DIo/RC 增加，导致TRo/RC 稍有下降，以及ETo/RC 的显著下降。恢复期，ABS/RC和DIo/RC 随着恢复时间的延长而下降，TRo/RC 和ETo/RC 则迅速恢复至高于对照水平。恢复第1 天，前1h 反而导致ABS/RC 和DIo/RC 的大幅上升，随后又迅速下降；TRo/RC 在恢复6h 时即达到对照水平随后又持续上升，而ETo/RC 则表现为先下降后立即迅速上升至对照水平。

图4 两处理番茄叶片单位面积有活性的PSII 反应中心数目和单位活性反应中心比活性参数的比较Fig.4 Comparison of the numbers of active PSII reaction centers (RCs) per cross section (CS) and specific energy fluxes of RCs in leaves between two treatments

3 结论与讨论

3.1 讨论

低温对光合机构，尤其是PSII，具有破坏作用[12]。PSII 作为光化学反应中心涉及了光能的吸收、转换与电子传递等光合过程[12,19]。低温胁迫显著抑制了番茄叶片PSII 活性[20]，导致PSII 光化学效率的下降和光抑制的发生[2,5]，并且光抑制程度随着温度的降低和胁迫时间延长而加重[21]。本试验结果显示低温处理1h 即引起番茄叶片PSII 光化学效率的降低和光抑制的发生，而低温处理4d 后转入常温下恢复1h 时Fv/Fm 仍下降，这表明低温处理后恢复初期较强的光照对番茄叶片恢复是不利的。胡文海等研究也表明，低温后恢复期弱光有助于番茄叶片光抑制恢复，而全光照则加剧了光抑制程度[22]。

PIABS是指以吸收光能为基础的PSII 性能指数，是捕光色素光能的吸收、PSII 对光能的捕获和电子传递三方面的综合反映[23-25]。本实验中，低温处理下PIABS先于Fv/Fm 下降，且下降幅度大于Fv/Fm，而其恢复速率则慢于Fv/Fm。由此可见，PIABS比Fv/Fm 对低温更敏感，且PSII 光合性能的恢复速率慢于光抑制。进一步分析可知，低温处理导致番茄单位面积光能的吸收（ABS/CS）和有活性的PSII 反应中心密度（RC/CS）显著下降，反应中心捕获的激子将电子传递到电子传递链中超过QA的其它电子受体的概率（Ψo）也下降，即照光2ms 时有活性的反应中心的开放程度下降[16]，从而使得反应中心对光能的捕获能力（TRo/CS）下降，减少了单位面积上进入超过QA-电子传递链中的还原能（ETo/CS）和用于电子传递的量子产额（φEo）。由此可见，低温下PSII 光合性能的下降是天线色素对光能的吸收、PSII 对光能的捕获以及光合电子传递三个方面均受到抑制的综合结果。武辉等[26]采用调制式叶绿素荧光和气体交换技术在棉花幼苗叶片光合特性对低温胁迫的研究也表明，低温导致棉花幼苗叶片PSII 反应中心光能吸收、转化和电子传递受到严重阻碍。但在恢复期，ABS/CS 和TRo/CS 能得到快速恢复，而ETo/CS 和φEo 的恢复速率相对较慢，这意味着天线色素对光能的吸收和PSII 对光能的捕获能力较电子传递更易于恢复。

陈静等[27]研究表明，低温弱光（2 ℃，100μmol·m-2·s-1）对番茄幼苗叶片PSII 具有显著的抑制作用，但对PSI 活性影响不大。PItotal反映了光合电子在PSII 和PSI 之间的传递及光合系统状态的综合性能指数[24,28-29]。本实验中，PIABS和PItotal呈现出相同的变化趋势，并且两个参数在低温处理期的下降幅度和恢复期的上升幅度也基本一致，这表明低温对PSII 的影响大于PSI，PItotal的变化主要受PIABS的影响。同时，本实验中还观察到用于还原PSI受体侧末端电子受体的量子产额（φRo）的变化趋势与φEo 一致，这意味着电子向PSI 受体侧电子受体传递受阻的主要原因是由于低温抑制了PSII 受体侧的电子传递引起的，这将对PSI 起到保护作用。张子山等[30]研究表明，低温胁迫（2℃）下光强增加的初始阶段（0～200μmol·m-2·s-1）黄瓜叶片PSI 对光强的增加非常敏感，但随着光强的进一步增加（＞200μmol·m-2·s-1），PSII 的光抑制程度持续加重，限制了电子由PSII 向PSI 的传递，保护了PSI 免受强光的进一步破坏。

植物叶片有活性的PSII 反应中心可以将叶片捕获的光能转化为激发能，其中一部分转化为化学能用于碳同化，其它部分则以热或荧光的形式耗散掉。逆境胁迫下PSII 反应中心失活分为可逆失活和不可逆破坏两种类型[31-32]，其中PSII 反应中心可逆失活能够吸收光能但不传递给电子传递链而成为一个能量陷阱，这种可逆失活的反应中心在逆境解除后又可恢复活性，因此被认为是一种保护机制[16]。番茄叶片单位面积有活性的反应中心数目（RC/CS）在低温处理第1 天即显著下降，并在恢复第1 天即大幅上升，这表明本实验的低温胁迫主要是诱导了PSII反应中心的可逆失活。进一步分析光合机构的比活性可以确切反映植物光合器官对光能的吸收、转化和耗散的状况[24]。低温处理导致ABS/CS、TRo/CS和ETo/CS 的大幅下降和DIo/CS 增加，这意味着低温减少了天线色素对光能的捕获，进而导致番茄叶片单位面积上用来还原QA的激发能（TRo/CS）和进入超过QA-电子传递链中的还原能（ETo/CS）减少，与此同时，低温胁迫诱导了单位面积热耗散（DIo/CS）增加。这说明番茄遭受低温胁迫后立即启动了相应的防御机制，一方面通过PSII 反应中心的可逆失活和减少光能的吸收以防御过剩光能的吸收与积累，另一方面诱导了热耗散保护途径的增强。恢复期ABS/CS、TRo/CS 和ETo/CS 均能快速向对照水平恢复也说明低温并未对番茄叶片PSII 反应中心造成破坏。有研究表明，高温、低温和干旱等逆境胁迫下RC/CS 的下降会迫使作物剩余有活性的反应中心效率的提高，表现为ABS/RC、TRo/RC、ETo/RC和DIo/RC 的增加[16,32-33]。本实验中，低温促进了ABS/RC 和DIo/RC 的提高，但TRo/RC 和ETo/RC 仍下降，尤其是ETo/RC 仅为对照的39.3%，这说明低温抑制了有活性的PSII 反应中心对光能的捕获和驱动进行电子传递的能力，而多余的光能可以通过提高热耗散的方式进行消耗以减少PSII 过剩激发能的积累，这一结果与Liang 等[34]在低温处理下麻风树（Jatropha curcas）幼苗中的结果相一致。而恢复期RC/CS、TRo/RC 和ETo/RC 均能随着恢复时间的延长而快速恢复，这也说明本实验中低温处理并未对PSII 反应中心造成破坏，更可能是可逆失活。

Mo、Ψo、Sm 和φEo 等参数主要反映了PSII 受体侧的变化。Mo 反映了初级醌受体（QA）被还原的最大速率，当反应中心活性下降时，QA被还原速率加快，即Mo 增加[24]，而抑制QA-往下的电子传递也会导致Mo 的上升[16]。本实验中，Mo 在低温处理第1 天急剧上升，第2 天则有较大幅度的下降并维持不变，在恢复期则呈现先上升后下降趋势。究其原因，认为这是由于低温处理第1 天既大幅降低了有活性的反应中心活性开放程度（Ψo），又降低了捕获的光能把电子传递到电子传递链中超过QA-的电子受体的概率（φEo），从而使得较多的光能用来还原QA，QA的还原加速。但低温处理第1 天即诱导了用于热耗散的量子比率（φDo）的增大，并在处理第2 天时达到最大；而Sm 则较φDo 迟1d 显著增加，并在第3 天达到最大。这意味着低温首先诱导了热耗散的增强，随后促进了PSII 受体侧电子传递体PQ 库的增加，这将有利于减轻PSII 的激发压，从而使得Mo在低温处理第2 天有所回落。而当番茄移入常温下恢复时，整体上来看常温有利于番茄叶片单位面积中有活性的PSII 反应中心数目（RC/CS）和开放程度（Ψo）的恢复，从而促进了捕获的光能更多用于驱动QA-往下的电子传递（φEo）。但是，本研究也发现，当番茄由低温环境移入常温光下最初1h，突然增强的光照反而导致了PSII 反应中心开放程度（Ψo）和PQ 库容量（Sm）的大幅下降，从而使得Mo 反而增加，这说明光强在低温胁迫后的恢复中起着重要作用，强光不利于作物低温胁迫后的恢复，这与前期研究结果相一致[22]。

本研究以番茄为试验材料，对番茄叶片PSII 功能和受体侧电子传递对短期8℃低温处理及随后恢复阶段的响应作了详细分析，可以为设施生产中防御番茄苗期低温弱光胁迫提供一定的科学依据。短期8℃低温胁迫主要引起番茄叶片PSII 反应中心的可逆失活，并未造成番茄叶片严重光抑制伤害，而恢复初期的强光反而会加重光抑制程度。因此，在番茄设施生产中遭遇低温弱光后可考虑适当遮荫，以防止阴雨天后晴天强光加重番茄叶片光抑制伤害。此次实验中只设置了8℃低温处理，未设置2～4℃重度低温处理，不能比较番茄叶片PSII 功能和受体侧电子传递在重度和中度低温胁迫下的差异；恢复期只设置了600μmol·m-2·s-1强光恢复，而未设置100～200μmol·m-2·s-1弱光恢复，因此只能得出强光会加重恢复初期番茄叶片光抑制程度，而未能就弱光是否有利于低温光抑制恢复进行实证研究。未来可以增加番茄叶片JIP-test 参数对不同低温处理和恢复期不同光强处理响应的对比。