产共轭亚油酸菌株的筛选及其发酵性质研究

洛 雪，刘 瑛，时 旭，史海粟，乌日娜，武俊瑞，杨巍巍，岳喜庆*

（1 沈阳农业大学食品学院 沈阳112000 2 沈阳医学院公共卫生学院 沈阳110034）

天然的CLA 主要存在于动物、植物、海产品中，如在牛、羊等反刍类动物的乳脂和肉制品中含量较高[1-2]。c9，t11-CLA 还被命名为瘤胃酸（rumenic acid）。自上世纪50年代开始，人们接连在反刍动物的脂肪组织、烤牛肉中[3-6]发现了CLA，并证实其抗癌功能[7]。发酵乳是经乳酸菌发酵动物乳而制成的，因独特的滋味和特殊的营养价值而受到人们的喜爱。对发酵乳产品的检测，包括感官评价、理化指标、污染物限量、真菌毒素限量、微生物限量、乳酸菌数等。对发酵乳发酵性能的检测包括质构、流变、滋味、气味、持水性等指标。

目前，在原始发酵乳基础上加入其它营养物质，以提高发酵乳的营养特性、风味特性和发酵特性的产品越来越多。加入益生菌的发酵乳营养更加丰富，摄入的益生菌在人体内积累定植后，对改善宿主体内的微生态平衡具有重要作用，益生菌乳制品同时还具有缓解乳糖不耐症，抗高血压，降低生殖道感染风险，促进Ca2+吸收和维生素生成等功能[8-9]。许多可生产CLA 的菌株均为乳酸菌[10]，可用于发酵。当使用能生产CLA 的菌株生产功能性乳制品时，便可将CLA 较好地融入产品中，从而利于乳制品的多种有益功能[11-14]。有研究发现，将产CLA 的乳酸乳球菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌复配后发酵牛奶，所得产物中CLA 最大值为56.51 mg/mL[15]。目前大多CLA 在食品中应用较少，如何能获得高产CLA 的乳酸菌并应用于发酵乳中，具有较大的意义[16]。本研究从发酵乳中筛选菌株，得到产共轭亚油酸的菌株，将其直接用于制作发酵乳，研究该菌株的发酵性能，测定CLA 的产量，评估发酵乳的综合指标，以获得CLA 含量高，品质好的发酵乳。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵乳样品和纯牛奶采自内蒙古呼和浩特和呼伦贝尔，采集后置于无菌容器，放于冰盒中带回。

革兰氏染色液试剂盒，索莱宝科技有限公司（北京）；细菌DNA 提取试剂盒，康为世纪生物科技有限公司（ 北京）；DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker，大连宝生物；2×Es Taq Master Mix（Dye）、6×SuperStain Loading Buffer，北京康为世纪；溶菌酶，北京索莱宝；琼脂糖，北京中科瑞泰生物；亚油酸（LA），90%纯度，上海联迈生物；共轭亚油酸标准品（CLA），Sigma 公司。

1.2 仪器与设备

PCR 仪（Eppendorf）、高速冷冻离心机（Eppendorf），德国Eppendorf 公司；超微量核酸蛋白定量仪（Thermo Fisher），Thermo Fisher 公司；质构仪（BROOKFIELD），美国BROOKFIELD；电子舌（Insent），日本Insent。

1.3 试验方法

1.3.1 传统发酵乳中乳酸菌的分离纯化 发酵乳梯度稀释后涂布MRS 平板，37 ℃培养2 d。挑取菌落状态不同的透明和半透明单菌落，每个单菌落经过3～4 次划线纯化后，37 ℃，静置培养24～48 h，保存备用。

1.3.2 革兰氏染色鉴定 挑取待检菌落于载玻片，滴入生理盐水稀释，固定后进行染色，具体操作见革兰氏染色液试剂盒说明书，染色后于显微镜下观察菌体形态。

1.3.3 CLA 含量测定 选取CLA 质量浓度为0.0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0 μg/mL 的样品，测定吸光度值（λ=233 nm），制作标准曲线。

选取革兰氏染色阳性菌株接种MRS 培养基（0.5 mg/mL LA），37 ℃培养24～48 h，加入正己烷充分振荡，4 ℃，10 000 g 离心10 min，取上清液测定吸光度值（λ=233 nm），根据标准曲线计算生成CLA 的含量。

1.3.4 16 s rDNA 鉴定菌种 利用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取已筛选的乳酸菌基因组，稀释基因组DNA 至终质量浓度为20 ng/μL，以此为模板，用16 s 通用引物进行PCR 扩增，PCR 验证结果呈阳性的菌株送交上海派森诺生物科技股份有限公司测序。

1.3.5 单因素试验 以发酵乳的质构特性、滋味特性和CLA 产量作为考察指标，研究植物乳杆菌HAC01 接种量、发酵温度、发酵时间、发酵pH 值、LA 添加量，发酵结束后后熟时间对发酵性质的影响。利用质构仪测定硬度、稠度、黏度、黏聚性等指标，测定条件及参数为：探针选择直径为2.5 cm 的平底圆柱形探针，测定模式选择阻力测试，感应力选择自动感应10 g，测定前下降速度1.0 mm/s，测定速率2.0 mm/s，测定后速度8 mm/s，进入样品深度20 mm，对测试样品进行两次压缩，间隔时间5 s。利用电子舌测定样品的综合味觉信息，指标包括酸、甜、苦、咸、鲜。

1.3.6 均匀设计 使用DPS 数据处理系统V7.05进行均匀设计和数据分析，优化反应条件。

2 结果与讨论

2.1 乳酸菌分离纯化

为得到具有较高CLA 产量的菌株，本试验从采集的发酵乳样品分离纯化菌种，利用菌落形态和革兰氏染色进行初步鉴定，结果如表1所示，乳酸菌菌落形态基本呈半透明、圆形隆起状，革兰氏染色为阳性。

表1 菌株分离初鉴定表Table 1 Preliminary identification of strains

2.2 菌株CLA 含量

测定筛选出的25 株革兰氏阳性菌的CLA 产量，结果见图1所示，其中产量最高的为7 号菌株，CLA 产量为（2.7197±0.0056）μg/mL，选取产量相对高的10 株菌进行后续试验；CLA 标准曲线如图2所示，由标准曲线得到回归方程：Y=0.0741X+0.0032，线性相关系数R2=0.9991。

图1 菌株CLA 产量Fig.1 Production of CLA in selected strains

图2 CLA 标准曲线Fig.2 CLA standard curve

2.3 菌株鉴定

选取CLA 含量最高的10 株菌提取基因组DNA 进行16S rDNA 鉴定，结果如图3所示。筛选菌株均在1 700 bp 左右有特异性条带，送交公司测序。测序结果在NCBI 中比对后如表2所示，其中瑞士乳杆菌3 株，副干酪乳杆菌2 株，戊糖片球菌、克菲尔乳杆菌、植物乳杆菌、屎肠球菌各1 株，选择CLA 产量最高的植物乳杆菌，命名为HB-01测定其发酵性质。

表2 菌株鉴定表Table 2 Table of strain identification

图3 16S 鉴定Fig.3 16S identification

2.4 发酵条件对发酵乳质构的影响

将植物乳杆菌接种纯牛奶发酵进行单因素试验，所得发酵乳的质构变化如图4～图8所示。

图4 不同发酵温度下发酵乳的质构特性Fig.4 Texture characteristics of fermented milk at different temperatures

图8 不同LA 添加量下发酵乳的质构特性Fig.8 Texture characteristics of fermented milk at different LA concentrations

不同发酵温度所得发酵乳的质构结果表明，硬度、黏度、胶着性和咀嚼性随温度的增加呈先上升后下降的趋势，在37 ℃时发酵乳的硬度最大（0.2300±0.0100）N。不同发酵时间所得发酵乳的质构结果表明，硬度、黏度、胶着性和咀嚼性的值在36 h 为最大值，硬度最大为（0.2467±0.0058）N，发酵性能更好。不同接种量所得发酵乳的质构结果表明，硬度、黏度、胶着性和咀嚼性的值在4%为最大值，硬度最大为（0.2567±0.0115）N。不同pH 值所得发酵乳的质构结果表明，硬度、黏度、胶着性和咀嚼性的值随pH 值的变化不大，在pH 值为6.5 时硬度最大为（0.2200±0.0100）N。不同LA添加量所得发酵乳的质构结果表明，硬度、黏度、胶着性和咀嚼性的值随LA 添加量的变化不大，在0.5 mg/mL 时硬度最大为（0.2333±0.0115）N。

2.5 发酵条件对发酵乳滋味的影响

植物乳杆菌接种纯牛奶进行发酵试验，发酵乳经电子舌检测结果如图9～图13所示。结果显示，温度、接种量和pH 值对成品的酸度影响较大，随着温度的升高酸度逐渐加强，甜味、苦味、咸味和鲜味无明显变化，发酵时间和LA 添加量与5种滋味的关联性也不大，所以选择适宜的发酵温度、接种量和pH 值有利于得到滋味更好的发酵乳。

图5 不同发酵时间下发酵乳的质构特性Fig.5 Texture characteristics of fermented milk at different time

图9 不同发酵温度下发酵乳的滋味Fig.9 Taste of fermented milk fermented at different temperatures

图13 不同LA 添加量下发酵乳的滋味Fig.13 Taste of fermented milk fermented at different LA concentrations

图6 不同植物乳杆菌接种量下发酵乳的质构特性Fig.6 Texture characteristics of fermented milk at different inoculations

图7 不同pH 值下发酵乳的质构特性Fig.7 Texture characteristics of fermented milk at different pH

2.6 发酵条件对CLA 产量的影响

根据单因素试验，得到CLA 产量的结果如图14所示。

图14 不同发酵条件下发酵乳的CLA 含量Fig.14 CLA content of fermented milk under different conditions

从结果看，发酵乳的CLA 产量随植物乳杆菌接种量、发酵温度、发酵时间、发酵pH 值、LA 添加量的增加而逐渐增大，最后又有小幅度降低，其中LA 添加量的影响最大。根据质构、滋味和CLA 含量结果，得到最优反应条件为：接种量4%，LA 添加量0.5 mg/mL，在pH 6.5、37 ℃条件下发酵36 h，4 ℃后熟12 h，所得发酵乳的状态和CLA 含量最佳。

经过单因素试验后发现，随着接种量、发酵温度、发酵时间、发酵pH 值、LA 添加量的不断升高，硬度、黏度、胶着性和咀嚼性等性质总体上呈先上升后下降的趋势，虽然个别仍会升高，但增幅不大，相比较而言，温度、时间、植物乳杆菌接种量对发酵乳的质构影响更大。有研究发现，当搅拌型酸奶的硬度值在33.9～39.9 g（1 g=0.00981 N）的范围口感较好，硬度对胶着性和咀嚼性都有一定影响[17-18]。由该菌株发酵所得发酵乳不管如何改变发酵条件，所得发酵乳的硬度、黏度、胶着性、咀嚼性等指标与普通的发酵乳相比都存在偏小的情况，原因可能是正常发酵乳在发酵过程中会加入乳粉、明胶等增加发酵乳的固形物含量，从而提高发酵乳的硬度、黏性等流变性能和质构性能[19]，本部分试验主要目的是研究植物乳杆菌的单一发酵性质，为后续优化CLA 产量奠定一定基础，所以未添加其它物质。

2.7 均匀设计优化试验

图10 不同发酵时间下发酵乳的滋味Fig.10 Taste of fermented milk fermented at different time

图11 植物乳杆菌不同接种量下发酵乳的滋味Fig.11 Taste of fermented milk at different inoculum of Lactobacillus plantarum

图12 不同pH 值下发酵乳的滋味Fig.12 Taste of fermented milk fermented at different pH

用DPS 设计的均匀设计表进行试验并得到结果，对质构和滋味结果进行评价转换，状态越好分值越高，转换结果满分为10 分，所得结果Y1、Y2、Y3用模糊数学进行数值标准化[20-21]处理后得Y1*、Y2*、Y3*，再以bn=0.30Y1*+0.30Y2*+0.40Y3*为目标因变量进行二次多项式逐步回归，结果见表3，获得的回归方程为：Y*=0.6817+0.0225X1-0.0004X1X1-0.0008X3X3-0.0001X1X2+0.0442X3X5，其中Y*为综合评价bn，所得相关系数R2=1，F值=4 628.4073，显著水平P=0.0112，剩余标准差S=0.0013，由此得到指标最高时的组合为X1=37，X2=32，X3=4，X4=6.5，X5=0.7 与实际基本一致，符合试验要求。

表3 均匀设计发酵试验水平表及结果Table 3 Table and results of uniform design fermentation experiment

3 结论

发酵乳样品经筛选鉴定一株CLA 产量相对较高的植物乳杆菌，利用单因素试验和均匀设计试验优化植物乳杆菌发酵性能，结果显示，在接种量4%，LA 添加量为0.7 mg/mL，pH 6.5、37 ℃条件下发酵32 h，4 ℃后熟12 h，发酵乳的性能较好，CLA 含量最高。均匀设计的优化结果与其相似，为后续基因改造植物乳杆菌，提高CLA 产能和CLA生成机理研究奠定一定基础。